Leptina (gena ob) a broaștei cu gheare sud-africane Xenopus laevis PNAS

  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Editat de Jeffrey M. Friedman, Universitatea Rockefeller, New York, NY și aprobat pe 12 mai 2006 (primit pentru revizuire 29 august 2005)

gena

Abstract

Hormonul proteic leptina este o citokină de tip I secretată de adipocite care acționează asupra SNC pentru a regla aportul alimentar și metabolismul (1, 2). În plus față de reglarea greutății corporale, leptina influențează reproducerea, creșterea, răspunsurile la stres și funcția tiroidiană (3, 4). Acțiunile leptinei sunt atât acute, cât și cronice. De exemplu, creșterile postprandiale ale leptinei plasmatice inhibă consumul de alimente, în timp ce concentrațiile medii zilnice de leptină plasmatică comunică starea energetică pe termen lung creierului (5). Aceste acțiuni sunt mediate de receptorii de leptină membranară (LR), dintre care șase izoforme au fost identificate la mamifere (6). Legarea leptinei de forma lungă a LR (LRb) activează transductorul de semnal Janus kinase 2/și activatorul căii de semnalizare a transcripției 3 (STAT-3) (7), care mediază efectele leptinei asupra consumului de alimente, metabolismul glucozei și creșterea în greutate dar nu afectează fertilitatea (8).

Prevalența crescândă a obezității umane și a tulburărilor metabolice (9) a concentrat cercetările asupra rolului fiziologic al leptinei în echilibrul energetic și aportul alimentar la mamiferele adulte. Recent, legăturile dintre greutatea la naștere și tulburările metabolice la debutul adulților (10) au îndreptat atenția asupra posibilelor relații dintre leptină, creștere și dezvoltare în timpul etapelor fetale. Leptina circulantă este crescută la fătul uman în timpul gestației târzii și se corelează cu masa grasă și greutatea la naștere (11, 12). La șoarece fetal, leptina și LR sunt exprimate în ficat, inimă, foliculi de păr și os primordial înainte de formarea țesutului adipos (13, 14), iar leptina se găsește în circulația ovinelor fetale (15). Deși aceste modele de exprimare sugerează un rol pentru leptină la făt, se știe puțin despre funcțiile leptinei în dezvoltarea timpurie.

În acest articol, raportăm despre clonarea moleculară a omologilor de broască a genelor receptorilor ob și ob de mamifere (obr) și caracterizarea funcțională a produselor proteice ale acestor gene la un vertebrat nonamniot. Broasca leptină și LR (corespunzătoare LRb la mamifere) sunt exprimate de-a lungul embriogenezei și dezvoltării mormolocului și sunt exprimate pe scară largă la broasca juvenilă. Injecția intracerebroventriculară de leptină de broască recombinantă (rxLeptin) a exercitat efecte anorexigenice puternice la mormolul midprometamorfic și la broasca juvenilă, dar nu și la mormolul prometamorfic timpuriu. LR este exprimat în membrul posterior al mormolilor prometamorfici timpurii, iar tratamentul cu rxLeptin a indus creșterea membrelor posterioare și formarea cifrelor in vivo și a stimulat absorbția [3H] timidinei in vitro. Astfel, pe lângă rolul său integral de regulator al apetitului și al echilibrului energetic, leptina poate îndeplini și funcții noi ale factorilor de creștere în timpul dezvoltării timpurii.

Rezultate

Clonarea moleculară a genelor Frog ob și obr.

Am izolat și secvențiat regiunea de codificare a unei gene Xenopus laevis ob, împreună cu 5 'UTR complet și ≈600 pb din 3' UTR. Produsul proteic prezis de 16,9 kDa al genei broască ob are o peptidă semnal 21-aa și o peptidă matură 148-aa. Gena leptinei broaște are trei exoni și doi introni, cu secvența codificatoare în exonii 2 și 3, similară cu structura genomică a genelor ob mamifere (Fig. 1 A). Broasca leptină este 35% similară cu cea umană, 34% asemănătoare cu puiul, dar numai 13% similară cu o leptină supusă pufferfish (ref. 16; Fig. 1 B). Structurile terțiare prevăzute ale leptinelor de broască, șobolan și pește puffer derivate din algoritmul SWISS - MODEL (17) sunt foarte conservate în ciuda divergenței considerabile în structurile primare dintre specii (Fig. 1 C).

Caracterizarea moleculară a leptinei de broască. (A) Structura genomică prezisă a genei ob broască este păstrată la om. Umbrirea întunecată arată regiunile de codificare. (B) Alinierea aminoacizilor a leptinelor vertebratelor. Vârfurile de săgeată prezintă cisteine ​​conservate. Nr. De acces GenBank. sunt după cum urmează: X. laevis, AY884210; uman, NP000221; război, BAA08296; pui, AF012727; pufferfish (Tetraodon), AB193549. (C) Diagramele pe panglică ale structurilor terțiare prezise ale leptinelor X. laevis, șobolan și pufferfish (SWISS - MODEL server automatizat de modelare a omologiei proteinelor; bazat pe fișierul structurii 1AX8.pdb a leptinei umane Protein Data Bank).

De asemenea, am izolat un ADNc de lungime completă corespunzător unei gene supuse obr din plămânul Xenopus tropicalis. Gena prognozată a broaștei (Fig. 2 A) se întinde pe 87,3 kb de ADN genomic și constă din 26 de exoni, 8 exoni de 5 ′ UTR (826 bp) și 18 exoni de secvență codificatoare (3.436 bp; 1.145 aa) și parțial 3 ′ UTR (129 pb). Proteina LR de broască prezisă este 37,5% identică cu LR umană; similitudinea secvenței este cea mai mare în și în jurul domeniului de legare a ligandului, regiunea transmembranară și regiunea C-terminală intracelulară (vezi informațiile de susținere, care sunt publicate pe site-ul web PNAS). Această secvență include exonul terminal 922-bp care corespunde exonului terminal extins al mamiferelor, care codifică domeniul intracelular C-terminal al formei lungi LR. La mamifere, două reziduuri de tirozină (Tyr-985 și Tyr-1138 la șoarece) din acest exon sunt esențiale pentru semnalizarea intracelulară (7), iar aceste reziduuri sunt conservate în broasca obr (a se vedea informațiile de susținere). Algoritmul ProDom (18) a confirmat că această secvență de ADNc este un omolog de broască al genelor obr de mamifere (la P signalp 3.0 (20) a prezis o peptidă de semnal în primii 21 bp ai secvenței de codare, care este egală ca dimensiune cu peptida de semnal a LR uman.

Exprimarea mRNA-urilor de leptină și LR la broască. (A) Distribuția țesuturilor la broaște juvenile de mRNA de leptină și LR a fost analizată prin RT-PCR cantitativă (vezi Metode). Nivelurile de ARNm de Leptină și LR au fost normalizate la expresia genei proteinei ribozomale L8 (rpL8). (B) Expresia de dezvoltare a mARN-ului leptinei în X. laevis a fost analizată prin RT-PCR semicantitativă (vezi Metode).

Analize de admisie alimentară.

Efectele i.c.v. injectarea rxLeptinei la timpul petrecut în căutarea la mormoloci S. hammondii prometamorfici sau midprometamorfici timpurii și la mărimea mesei la puietul X. laevis. Scrisorile indică diferențele perechi ale Duncan între tratamente [P 3 H] Absorbția timidinei in vitro.