JCI - Întreruperea țintită a receptorilor H3 are ca rezultat modificări ale tonusului histaminei cerebrale care duc la o

Kazuhiko Takahashi, Hiroaki Suwa, Tomoo Ishikawa și Hidehito Kotani

Genomică funcțională, Institutul de cercetare Banyu Tsukuba în colaborare cu Merck Research Laboratories, Tsukuba, Ibaraki, Japonia

Adresă corespondență către: Hidehito Kotani, Institutul de Cercetare Banyu Tsukuba, Okubu 3, Tsukuba, Ibaraki, 300-2611, Japonia. Telefon: 298-77-2202; Fax: 298-77-2027; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Takahashi, K. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Genomică funcțională, Institutul de cercetare Banyu Tsukuba în colaborare cu Merck Research Laboratories, Tsukuba, Ibaraki, Japonia

Găsiți articole de Ishikawa, T. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Genomică funcțională, Institutul de cercetare Banyu Tsukuba în colaborare cu Merck Research Laboratories, Tsukuba, Ibaraki, Japonia

Publicat la 15 decembrie 2002 - Mai multe informații

Histamina este o substanță bioactivă puternică care a fost studiată de aproape un secol. Histamina este stocată în mastocitele țesuturilor periferice, iar eliberarea histaminei a fost implicată în patogeneza diferitelor reacții inflamatorii (1 - 3). De asemenea, histamina este un neurotransmițător aminergic localizat în SNC și sistemul nervos periferic. Neuronii histaminergici sunt localizați exclusiv în nucleul tuberomamilar (TM) al hipotalamusului posterior și își proiectează axonii în regiuni cerebrale, inclusiv hipotalamusul, talamusul, cortexul cerebral, amigdala și septul (4 - 7).

Analiza genotipării Southern blot. Am folosit fragmente 865-bp și 965-bp situate în afara vectorului de țintire pe partea 5 'și 3' ca probe pentru a examina clonele de celule ES direcționate corect și șoarecii mutanți ulteriori. Întreruperea țintită a secvenței de codificare a receptorului H3 cu caseta de rezistență PGK-neo a introdus un site BamHI suplimentar. În consecință, sondele de 5 ′ și 3 ′ au detectat fragmente BamHI de aproximativ 12 kb și respectiv 8,5 kb din celule ES care conțin alela receptorului H3 țintit.

Analiza compoziției corpului. Masa grasă și masa corporală slabă au fost măsurate așa cum s-a descris anterior (33); Șoareci femele de 20 până la 25 de săptămâni și femele de 16 până la 17 săptămâni ( = 3 sau 4) au fost utilizate.

Analiza expresiei H1, H2 și H3. Analiza Northern blot a fost efectuată folosind 4 μg de ARN total al creierului pentru H3 și 4 μg de ARNm cerebral pentru hibridizările H1 și H2. Sonda de hibridizare a constat din ADNc H3 de șoarece (poziții 432–1116), ADNc H1 uman (poziții 190–977), ADNc H2 uman (poziții 231–1026) și GAPDH uman (poziții 586–1037).

Analiza expresiei UCP1, UCP2 și UCP3. ARN-ul total a fost izolat din țesutul adipos maro (BAT), țesutul adipos alb (WAT) și mușchiul scheletic. Cinci micrograme de ARN total au fost analizate prin Northern blot. Sondele de hibridizare au constat din cADN-ul UCP1 de șoarece (pozițiile 745-11005), cADN-ul UCP2 de șoarece (pozițiile 870-1177) și cADN-ul UCP3 de șoarece (pozițiile 212-542). Măsurătorile densitometriei au fost efectuate de FUJIX BAS2000 (film Fuji, Tokyo, Japonia) și normalizate de GAPDH.

Măsurarea activității locomotorii. Am evaluat activitatea locomotorie a șoarecilor femele găzduite individual de 16 până la 21 de săptămâni ( = 9-11) cu un sistem fotobeam cu suport de colivie (15 × 25 × 12 cm) (Neuroscience, Tokyo, Japonia). Toate măsurătorile au fost luate timp de 4 zile în fiecare grup. Măsurătorile efectuate în ultimele 3 zile au fost utilizate pentru analiza datelor.

Analiza sângelui. Pentru testele de toleranță la glucoză, șoareci femele în vârstă de 26 până la 28 de săptămâni ( = 4-6) au fost postite 14 ore și li s-a administrat glucoză (2 g/kg) prin injecție intraperitoneală. Pentru testul de toleranță la insulină, insulina umană (0,75 U/kg; Novo Nordisk, Bagsværd, Danemarca) a fost administrată intraperitoneal la șoareci femele în vârstă de 26 până la 28 de săptămâni = 4-6) care a fost postit timp de 3 ore. Sângele a fost retras din coadă la momentele indicate. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate de AntsenseII (Daikin, Osaka, Japonia). Nivelurile plasmatice de leptină și insulină au fost măsurate prin ELISA (Morinaga, Yokohama, Japonia). Kituri comerciale de radioimunologie au fost utilizate pentru a măsura nivelurile de T4 fără plasmă (Dainabot, Tokyo, Japonia). Testele colorimetrice au fost utilizate pentru măsurarea colesterolului, triacilglicerinei (TG; KYOWA, Tokyo, Japonia) și a FFA (Wako, Tokyo, Japonia). Vârstele animalelor la testare au fost următoarele (pentru șoareci masculi și, respectiv, femele): pentru leptină, insulină și T4, 11-18 și 13-16 săptămâni; pentru FFA și colesterol, 11-20 și 13-16 săptămâni; pentru TG, 14-19 și 17-24 săptămâni; iar pentru glucoză, 8-12 și 13-16 săptămâni.

Măsurători ale histaminei/tele-metilhistaminei. Șoarecii au fost decapitați fără injecție pargilină, iar creierul lor a fost îndepărtat rapid, plasat pe gheață și împărțit în cinci regiuni: creierul anterior (inclusiv cortexul și striatul), hipocampul, hipotalamusul/talamusul, trunchiul cerebral și cerebelul. Probele de creier au fost cântărite și omogenizate în 10 vol de acid percloric 0,2 N cu un sonicator. Omogenatul a fost centrifugat la 10.000 g timp de 5 minute la 4 ° C. Supernatantul a fost neutralizat (la pH 7-8) cu tampon borat 1 M (pH 9,25). Șoareci femele cu vârsta cuprinsă între 20 și 26 de săptămâni ( = 3) au fost utilizate. Am măsurat histamina prin ELISA (Immunotech, Marsilia, Franța) și vițel-metilhistamină de RIA (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suedia).

Administrarea intracerebroventriculară de tioperamidă și leptină. Medicamentele au fost injectate în cerebroventricul lateral drept (0,5 mm posterior, 1,0 mm lateral și 3,0 mm ventral spre bregmă) așa cum s-a descris anterior (34). Tioperamida (Tocris Cookson), neuropeptida Y (NPY; Peptide Institute, Osaka, Japonia) și leptina (Genzyme Techne, Minneapolis, Minnesota, SUA) au fost proaspăt dizolvate în soluție salină și infuzate la doze de 100 nmol, 2 μg și 0,5 μg per mouse, respectiv. Aportul alimentar a fost măsurat timp de 2 ore (tioperamidă și NPY) și 24 de ore (leptină) după perfuzie. Volumul perfuziei intracerebroventriculare a reactivilor a fost limitat la un volum total de 5,0 μl. Șoarecii utilizați pentru aceste experimente au fost șoareci masculi în vârstă de 20 până la 30 de săptămâni ( = 9) pentru tioperamidă și NPY și șoareci masculi de 18 până la 34 de săptămâni ( = 5) pentru leptină.

Administrarea intraperitoneală de tioperamidă. Tioperamida (10 mg/kg) și pargyline (65 mg/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, SUA) au fost injectate intraperitoneal la șoareci femele (vârsta de 37-54 săptămâni, = 4) pe un program de hrănire ad libitum. Creierul lor a fost îndepărtat rapid la 90 de minute după injectare. Întregul creier a fost folosit pentru vițel-testul metilhistaminei.