Investigație experimentală comparativă privind eficacitatea tulpinilor mono- și multiprobiotice în
Abstract
fundal
Pentru a investiga eficacitatea diferitelor tulpini probiotice, combinațiile și formele acestora (vii sau liofilizate) în prevenirea bolii hepatice grase nealcoolice (NAFLD).
Metode
Rezultate
Introducerea MSG în perioada neonatală duce la dezvoltarea NAFLD la șobolanii în vârstă de 4 luni. Pentru gradul de steatoză nu a existat nicio diferență semnificativă între grupul de obezitate MSG și grupurile de probiotice monocomponente liofilizate (III - V). Cea mai înaltă manifestare a steatozei a fost observată pentru B. animalis VKL (2,0 ± 0,25) în comparație cu B. animalis VKB (1,70 ± 0,21) și L. casei IMVB-7280 (1,80 ± 0,20). Modificările scorului steatozei între toate grupurile de monoprobiotice (III - V) au fost nesemnificative. Administrarea de la naștere atât a unui amestec probiotic viu (VII), cât și a unui liofilizat (VI) duce la o scădere semnificativă cu 69,5%
fundal
Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) variază de la steatoza simplă la steatohepatita nealcoolică (NASH) care poate avea diferite grade de fibroză și poate evolua către ciroză hepatică și carcinom hepatocelular [1]. NAFLD care este asociat cu obezitatea și diabetul de tip 2 are o prevalență de 15-20% în populația generală și 76-90% în obezitate [2]. NAFLD este în prezent o cauză principală a bolilor hepatice cronice [3, 4], care au dus la probleme semnificative de sănătate, cum ar fi morbiditatea, mortalitatea și transplanturile de ficat [5].
Conform modelului de două lovituri al patogenezei NAFLD, rezistența la insulină ca primă lovitură, provoacă acumularea de lipide în hepatocite și duce la dezvoltarea ficatului gras. Al doilea hit include insulte celulare, cum ar fi stresul oxidativ și oxidarea lipidelor, care dăunează celulelor hepatice și declanșează un proces inflamator care duce la modificări patologice ale hepatocitelor care duc la NASH [6]. Studii recente prezintă o dovadă clară că microbiota intestinală este puternic implicată în patogeneza și progresia NAFLD prin mai multe mecanisme [7].
Mecanismele care stau la baza, care leagă compoziția modificată a microbiotei intestinale de NAFLD sunt modularea metabolismului colinei dietetice [8] și producerea de etanol endogen [9], permeabilitatea intestinală crescută [10] cu endotoxemie ulterioară și inflamație metabolică de grad scăzut [11], creșterea recoltarea de energie din dietă [12] și sinteza afectată a acizilor grași cu lanț scurt [13], absorbția scăzută a vitaminelor și a compușilor activi biologic [12], metabolismul modificat al acizilor biliari și semnalizarea FXR/TGR5 [14]. Prebioticele și probioticele au funcții fiziologice care contribuie la sănătatea microbiotei intestinale și/sau la refacerea microflorei, menținerea unei greutăți corporale sănătoase și controlul factorilor asociați cu NAFLD prin diferitele căi menționate mai sus [15].
În lucrările noastre anterioare, am arătat că tratamentul periodic cu biomasă care conține multiprobiotice a 14 tulpini vii (Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Acetobacter) previne, cel puțin parțial, obezitatea indusă de MSG [16] și dezvoltarea NAFLD [17]. Cu toate acestea, întrebarea privind eficacitatea diferitelor tulpini probiotice, combinația și forma acestora (vii sau liofilizate) în gestionarea NAFLD rămâne deschisă, ceea ce a format obiectivele studiului actual.
Metode
Animale
Acest studiu a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator ale Institutelor Naționale de Sănătate și cu principiile etice generale ale experimentelor pe animale, aprobat de Primul Congres Național de Bioetică din Ucraina (septembrie 2001) . Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru etica experimentelor pe animale de la Universitatea Națională Taras Shevchenko din Kiev (numărul protocolului: 10/2014). Șobolanii au fost ținuți în cuști colective în condiții controlate de temperatură (22 ± 3 ° C), lumină (ciclu 12 ore lumină/întuneric) și umiditate relativă (60 ± 5%). Animalele au fost hrănite cu chow de laborator (PurinaW) și apă de la robinet ad libitum.
Proiectarea experimentelor
Studiul a inclus 70 de șobolani Wistar masculi împărțiți în 7 grupe, câte 10 animale în fiecare (Fig. 1). Șobolanii nou-născuți din grupul martor (I) au fost administrați cu soluție salină subcutanată (s.c.) în volumul de 8 μl/g la 2, 4, 6, 8 și 10 zile postnatale. Șobolanii nou-născuți din grupele II - VII au fost injectați cu soluție de glutamat monosodic (MSG) (4,0 mg/g greutate corporală) s.c. la 2, 4, 6, 8 și 10 zile postnatale [18]. Administrarea neonatală de MSG determină acumularea semnificativă de grăsime în abdomenul șobolanilor adulți. Acest lucru se întâmplă din cauza efectelor de neurotoxicitate asupra nucleelor arcuate și ventromediale ale hipotalamusului [19]. În lucrările noastre anterioare, am arătat dezvoltarea NAFLD în condiții de obezitate viscerală severă indusă de MSG [17]. Astfel, rezultatele obținute au confirmat validitatea utilizării MSG pentru dezvoltarea NAFLD.
Grupurile III - VII au fost tratate cu probiotice. Grupurile III-V au primit monoprobiotice liofilizate B. animalis VKL, B. animalis VKB, L. casei IMVB-7280 respectiv. Grupul VI a primit amestecul acestor trei tulpini probiotice. Grupul VII a fost tratat cu „Symbiter” multiprobiotic care a fost furnizat de către Compania Științifică și de Producție O.D. Prolisok ”. Conține 14 tulpini probiotice vii de Lactobacillus + Lactococ (6 × 10 10 UFC/g), Bifidobacterium (1 × 10 10/g), Propionibacterium (3 × 10 10/g), Acetobacter (1 × 10 6/g) genuri.
Administrarea a fost începută la sfârșitul celei de-a 4-a săptămâni după naștere și a continuat intermitent alternând un curs de 2 săptămâni și intervale de 2 săptămâni de netratare. În termen de 4 luni de la naștere, șobolanii urmau o dietă normală. Toți parametrii au fost măsurați la șobolani în vârstă de 4 luni.
Colectarea probelor și analiza biochimiei sângelui
Șobolanii din toate grupurile au fost postite timp de aproximativ 12 ore înainte de sacrificiu. Șobolanii au fost sacrificați prin luxație cervicală sub anestezie cu uretan. Sângele a fost extras din vârful ventriculului cardiac și puține picături de sânge au fost colectate într-un tub de microcentrifugă care conține un amestec de NaF și EDTA la un 2: 1 (w/w) raport. Proba de sânge a fost colectată într-un tub steril și centrifugată la 3500 rpm (2260 g) timp de 15 min. După centrifugare, supernatantul seric pentru analiză ulterioară a fost alicotat în tuburi de microcentrifugă și depozitat la -80 ° C. Bilirubina, activitatea alaninei și aspartatului aminotransferazei în ser a fost determinată prin metodele biochimice standard.
Evaluarea histologiei ficatului
Pentru analiza histologică au fost prelevate probe de țesut hepatic atât din lobul hepatic drept, cât și din cel stâng (dimensiunea probei 0,5 × 0,5 cm). După fixarea timp de 24 de ore într-un Buena lichid, fragmentele de ficat au fost deshidratate în alcool cu concentrații crescânde (de la 70 la 96 °), încorporate în parafină și apoi tăiate cu o grosime de 5-6 microni și colorate cu hematoxilin-eozină. Un patolog orbit de distribuțiile de grup a efectuat analize histologice ale diapozitivelor folosind microscopie cu lumină (Olympus, Japonia). Pentru a evalua modificările morfologice ale ficatului am folosit NAS (scor de activitate NAFLD), care include trăsături histologice și a fost definit ca suma neponderată a scorurilor pentru steatoză (0-3), inflamație lobulară (0-3) și balonare (0-2) ).). Conform scorurilor NAS ≥5 sunt diagnosticate ca steatohepatită nealcoolică (NASH) și cazuri cu test NAS 2. Diferența dintre grupuri a fost definită ca fiind statistic semnificativă atunci când a -valoarea a fost mai mică de 0,05.