Ingineria metabolică a lactatului dehidrogenază salvează șoarecii din acidoză Rapoarte științifice

Subiecte

Abstract

Acidoza cauzează milioane de decese în fiecare an și sunt necesare strategii pentru normalizarea pH-ului sanguin la pacienții cu acidoză. Calea lactatului dehidrogenază (LDH) are un potențial mare pentru tratarea acidozei datorită capacității sale de a transforma protoni și piruvat în lactat și, prin urmare, de a crește pH-ul din sânge, dar a provocat dezvoltarea unei terapii, deoarece nu există abordări farmaceutice pentru ingineria metabolică. căi in vivo. În acest raport demonstrăm că fluxul metabolic al căii LDH poate fi modificat cu compusul acid 5-amino-2-hidroximetilfenil boronic (ABA), care leagă lactatul și accelerează consumul de protoni prin transformarea piruvatului în lactat și creșterea NAD Raportul +/NADH. Am demonstrat aici că ABA poate salva șoarecii din acidoză indusă de metformină, prin legarea lactatului și creșterea pH-ului sângelui de la 6,7 ​​la 7,2 și a raportului NAD +/NADH din sânge de 5 ori. ABA este prima clasă de molecule care poate proiecta metabolic calea LDH și are potențialul de a avea un impact semnificativ asupra medicamentelor, având în vedere numărul mare de pacienți care suferă de acidoză.

Introducere

Acidoza are o rată de mortalitate de 50% în rândul pacienților cu afecțiuni critice. Acidoza este cauzată de disfuncția mitocondrială în producția de ATP, ceea ce duce la acumularea de protoni 1. Terapia actuală pentru acidoză lactică este tratamentul cu bicarbonat, care este ineficient din cauza numeroaselor sale efecte secundare toxice, cum ar fi modificarea tensiunii arteriale, declanșarea apoptozei și modificarea nivelurilor de pH intracelular 2,3,4,5. Dicloracetatul este un tratament potențial pentru acidoză, care îmbunătățește activitatea piruvat dehidrogenazei și blochează producția de lactat, totuși nu este eficient, deoarece provoacă neuropatie 6. Prin urmare, există o mare nevoie pentru dezvoltarea unor strategii care pot crește pH-ul sanguin la pacienții care suferă de acidoză 6,7,8,9 .

În acest raport prezentăm o nouă strategie pentru tratarea acidozei pe baza compusului ABA, care leagă lactatul și normalizează pH-ul sângelui prin creșterea consumului de protoni pe calea LDH. Mecanismul prin care ABA tratează acidozele este prezentat în Figura 1. ABA formează un complex bivalent cu lactat și, prin urmare, scade concentrația intracelulară de lactat, deplasând echilibrul către producția de mai mult lactat, rezultând consumul de protoni prin hidrogenarea piruvatului. Important, ABA este specific pentru lactat în comparație cu alți metaboliți, cum ar fi glucoza, datorită orto-hidroxilului său, care îl împiedică să se lege de cis-dioli 10. În plus, ABA crește și raportul NAD +/NADH, care are și numeroase efecte terapeutice, precum protecția împotriva apoptozei și suprimarea inflamației.

ingineria

Acidul 5-amino-2-hidroximetilfenil boronic (ABA) proiectează metabolic calea lactatului dehidrogenază și este o terapie pentru acidoză lactică.

ABA leagă lactatul și normalizează pH-ul sângelui prin deplasarea echilibrului căii LDH către consumul de protoni (prezentat în roșu), piruvat și generarea de NAD + .

Rezultate

ABA a fost identificat ca fiind terapeutic pentru acidoză datorită capacității sale potențiale de a lega lactatul. Prin urmare, am efectuat experimente pentru a determina dacă ABA formează un complex stabil cu lactatul. Complexul ABA-lactat a fost format prin amestecarea a 100 μmoli de ABA și lactat în 1 ml de metanol timp de 10 minute. Complexul ABA-lactat a fost apoi izolat folosind TLC preparativă, în acetat de etil și spectrometria de masă ESI a fost efectuată pe complexul izolat ABA-lactat. S-a obținut o greutate moleculară experimentală de 220,0786, care s-a corelat cu m/z prevăzută de 220,0786 și, prin urmare, sugerează că ABA formează un complex stabil cu lactatul.

De asemenea, am investigat dacă ABA ar putea lega lactatul în prezența altor metaboliți prezenți în ser, utilizând rezonanța magnetică nucleară cu bor (RMN). ABA și L-lactat de sodiu au fost adăugate la 500 μL de ser bovin fetal 10% în mediul modificat Eagle (DMEM) al Dulbecco și analizate prin RMN de bor. Figura 2B demonstrează că ABA leagă lactatul în prezența metaboliților prezenți în serul bovin fetal și DMEM. De exemplu, borul aromatic al ABA din ser are un vârf RMN la δ = 29 și acesta se deplasează la δ = 9 în prezența lactatului și a serului, demonstrând o complexare specifică cu lactatul. Schimbările de vârf obținute în urma acestor experimente s-au corelat cu schimbările de vârf obținute din RMN de bor a unui standard sintetic ABA-lactat (izolat prin TLC preparativă). Aceste date demonstrează că ABA complexează în mod specific lactatul și nu leagă niciunul dintre metaboliții prezenți în mod normal în ser și DMEM 10 .

ABA leagă lactatul, crește raportul NAD +/NADH și consumul de piruvat.

(A) RMN de bor al complexului izolat ABA-lactat. ABA liber are un vârf de bor la δ = 29 (vârf albastru), care se deplasează la δ = 9 pentru complexul ABA-lactat (vârf roșu). (B) ABA leagă lactatul de sodiu în prezență de 10% ser determinat de RMN de bor. ABA liber în ser are un vârf de bor la δ = 29 (vârf albastru), care se deplasează la δ = 9 în prezența lactatului echimolar (vârf roșu). (C) ABA crește raportul NAD +/NADH de două ori în celulele RAW 264,7. Celulele au fost incubate cu 0,1 M PBS sau 5 mM ABA timp de 5 min, lizatele celulare au fost recoltate și s-a măsurat raportul NAD +/NADH în lizatele celulare. (D) ABA scade nivelurile de piruvat de două ori în celulele RAW 264,7. Celulele au fost incubate cu 0,1 M PBS sau 5 mM ABA timp de 5 min, lizatele celulare au fost recoltate și nivelurile de piruvat din lizatele celulare au fost măsurate.

Pentru ca ABA să proiecteze în mod eficient calea LDH, trebuie să intre în celule. Prin urmare, am măsurat Logul D al ABA utilizând măsurători de absorbanță la 330 nm într-un test de partiție octanol/apă. ABA are un jurnal D de 0,80 ± 0,03, ceea ce sugerează că ABA ar trebui să fie permeabilă la membrana celulară. Capacitatea ABA de a spori piruvatul și consumul de NADH a fost investigată în celulele RAW 264.7. 10 6 celule RAW 264,7 au fost incubate cu 5 mM ABA, timp de 5 min și celulele au fost lizate, omogenizate și separate de proteine ​​pentru a analiza conținutul de piruvat, NAD + și NADH. Figura 2C demonstrează că ABA crește raportul NAD +/NADH de două ori și figura 2D demonstrează că nivelurile de piruvat sunt scăzute de 2 ori, sugerând astfel că ABA poate cataliza detoxifierea protonilor.

ABA este conceput pentru a epuiza nivelurile de lactat în timpul acidozei prin legarea lactatului și prin aceasta direcționând calea metabolică LDH către consumul de protoni în exces. Prin urmare, am investigat dacă ABA poate lega lactatul in vivo și îi poate reduce concentrația de sânge. 11 µmoli de ABA în 100 µL de soluție salină au fost injectați la șoareci prin vena cozii și după 10 minute sângele lor a fost analizat pentru lactat și comparat cu martorii. Figura 3A demonstrează că ABA poate reduce nivelurile de lactat din sânge, de exemplu, nivelurile de lactat din sânge la șoarecii sănătoși au fost de 2 ± 0,5 mM, cu toate acestea, șoarecii tratați cu ABA au avut o reducere de 3 ori a nivelurilor de lactat din sânge și au fost reduse la 500 ± 200 μM . ABA poate reduce nivelul de lactat extracelular de trei ori în decurs de 10 minute, acest efect rapid este esențial pentru tratarea acidozei datorită intervalului de timp rapid în care nivelurile crescute de protoni din sânge cauzează moartea. Important, la această doză ABA nu a cauzat pierderea în greutate la șoareci pe o perioadă de trei zile și nu am observat modificări ale nivelului de lactat/piruvat al creierului, de nivelurile NAD +/NADH sau ale pH-ului din sânge (figurile 3B, 4C).