Îmbătrânirea timpurie și patologiile legate de vârstă la șoarecii deficienți în BMAL1, componenta de bază a
Roman V. Kondratov
1 Departamentul de Biologie al Cancerului, Institutul de Cercetare Lerner, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA;
Anna A. Kondratova
2 Departamentul de genetică moleculară, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA
Victoria Y. Gorbacheva
1 Departamentul de Biologie al Cancerului, Institutul de Cercetare Lerner, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA;
Olena V. Vykhovanets
1 Departamentul de Biologie al Cancerului, Institutul de Cercetare Lerner, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA;
Marina P. Antoch
1 Departamentul de Biologie al Cancerului, Institutul de Cercetare Lerner, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA;
Abstract
Șoarecii deficienți în factorul de transcripție circadian BMAL1 (proteină asemănătoare creierului și mușchilor ARNT) au afectat comportamentul circadian și demonstrează pierderea ritmicității în expresia genelor țintă. Aici raportăm că șoarecii Bmal1 -/- au o durată de viață redusă și prezintă diferite simptome ale îmbătrânirii premature, inclusiv sarcopenie, cataractă, grăsime mai puțin subcutanată, contracție a organelor și altele. Fenotipul de îmbătrânire timpurie se corelează cu niveluri crescute de specii reactive de oxigen în unele țesuturi ale animalelor Bmal1 -/-. Aceste constatări, împreună cu datele privind controlul dependent de Ceas/BMAL1 al răspunsurilor la stres, pot oferi o explicație mecanicistă pentru debutul precoce al patologiilor legate de vârstă în absența BMAL1.
Rezultate si discutii
Deoarece fundalul genetic influențează semnificativ fenotipul unei mutații date de o singură genă la șoareci, pentru a aborda rolul BMAL1 în fiziologia normală, am transferat mai întâi mutația la tulpina de șoarece C56BL/6J (12 generații backcross). Datorită infertilității mutanților, colonia Bmal1 -/- a fost menținută prin reproducerea animalelor heterozigote, care a produs descendența tuturor celor trei genotipuri cu raportul așteptat. Animalele KO și colegii lor de tip sălbatic au fost monitorizați pe durata vieții lor pentru dezvoltarea tuturor tipurilor de modificări patologice.
Durata de viață a animalelor KO a fost semnificativ redusă în comparație cu colegii lor de tip sălbatic (Fig. (Fig. 1A). 1A). Majoritatea mutanților au murit între 26 și 52 săptămâni (durata medie de viață 37,0 ± 12,1 săptămâni), în timp ce niciunul dintre șoarecii de tip sălbatic sau heterozigoți nu a murit în perioada studiului (52 săptămâni). Durata medie de viață a animalelor C57BL/6J depășește 2 ani (Nadon 2006); mai mult de două ori mai lung decât cel observat la animalele KO. Cel mai longeviv mutant a murit la vârsta de 72 săptămâni, ceea ce este aproximativ de două ori mai scurt decât durata maximă de viață a acestei tulpini. Nu au fost observate diferențe de mortalitate dependente de sex.
Îmbătrânire prematură și moarte timpurie la șoareci Bmal1 KO. (A) Curba de supraviețuire Kaplan-Meyer. (Cercuri închise) Șoareci de tip sălbatic (WT); (cercuri deschise) șoareci KO. Animalele de tip sălbatic mai vechi de 1 an au fost sacrificate. (B) Modificări ale greutății corporale dependente de vârstă la bărbații de tip sălbatic (WT) și KO. (Cercuri închise) Șoareci de tip sălbatic; (cercuri deschise) șoareci KO. (C) Aspect gros de șoareci masculi de tip sălbatic (WT) de 1 an (dreapta) și KO (stânga). (D) Greutatea organelor majore de la șoareci de 40 de săptămâni. (Bare negre) tip sălbatic (WT); (bare gri) KO. Toate organele de la animale KO, cu excepția ficatului, sunt semnificativ mai mici decât animalele de tip sălbatic (p -/-. Colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) a secțiunilor transversale ale cvadricepsului femural de la animalele de 10 și 40 săptămâni ambele genotipuri. (F) Diferențiale WBC la animalele de tip sălbatic (WT) și KO în vârstă (10-wk-old) și în vârstă (40-wk). Fiecare stivă din bară reprezintă procentul tipului de celulă. (Limfocite (limfatice); monocite (mono); (eos) eozinofile; (baso) bazofile; (LUC) celule mari nepătate.
La naștere, animalele KO nu prezintă defecte vizibile și nu se disting de colegii lor de tip sălbatic. Cu toate acestea, la vârsta de 16-18 săptămâni (pentru bărbați și, respectiv, pentru femele), șoarecii Bmal1 -/- încep să prezinte o întârziere a creșterii, dovadă fiind greutatea corporală redusă. În timp ce greutatea animalelor de tip sălbatic a crescut constant pe parcursul celor 52 de săptămâni ale studiului, greutatea mutanților a încetat să crească la vârsta de 16-26 săptămâni și apoi a început să scadă (Fig. (Fig. 1B; 1B; Fig. Suplimentară). 1). Ca rezultat, șoarecii KO în vârstă de 52 de săptămâni au aproximativ jumătate din mărimea șoarecilor de tip sălbatic (Fig. (Fig. 1C 1C).
Pentru a investiga cauza pierderii în greutate corporală observată la animalele KO, am măsurat masa principalelor organe și țesuturi de la animale vechi de 10, 30 și 40 săptămâni din ambele genotipuri. La vârsta de 10 săptămâni, toate organele majore de la șoareci de tip sălbatic și KO aveau dimensiuni echivalente, cu excepția veziculelor seminale, care erau mai mici la animalele Bmal1 -/-. Această reducere, care devine mai accentuată odată cu vârsta, reflectă probabil maturizarea sexuală defectă la șoarecii KO, ducând la infertilitate masculină.
Diferențele în greutatea corporală totală a animalelor de tip sălbatic și KO în vârstă de 40 de săptămâni s-au dovedit în primul rând datorate scăderii masei adipoase și a țesutului muscular la șoarecii KO (Fig. (Fig. 1D). 1D). Masa medie a țesutului adipos intraabdominal a fost de 1,5 g la bărbații de tip sălbatic în vârstă de 40 de săptămâni, dar de numai 70 mg în KO-uri potrivite pentru vârstă și sex. Stratul de grăsime subcutanat a fost, de asemenea, redus semnificativ la mutanți (Fig. (Fig.2). 2). Acest fenotip este în contrast izbitor cu predispoziția la obezitate observată la șoarecii mutanți Clock/Clock (Turek și colab. 2005). Există mai multe explicații posibile pentru aceste fenotipuri contrastante. Complexul transcripțional CLOCK/BMAL1 nu poate fi format în celulele cu deficit de Bmal1, în timp ce în celulele Clock/Clock, proteina CLOCK mutantă păstrează capacitatea de a se dimeriza cu BMAL1. După cum s-a raportat recent, complexul CLOCK/BMAL1 afișează activitate funcțională dublă, funcționând atât ca activator transcripțional, cât și ca represor transcripțional, în funcție de interacțiunea sa cu CRY. În consecință, ambele funcții ale complexului se pierd în celulele cu deficit de Bmal1, în timp ce în celulele mutante de ceas doar transactivarea este afectată (Kondratov și colab. 2006b). Alternativ, diferențele fenotipice observate între șoarecii Bmal1 -/- și Clock/Clock ar putea fi explicați prin interacțiunea CLOCK și BMAL1 cu diferiți parteneri funcționali.
Patologii legate de vârstă ale pielii la șoareci KO. (A) Creșterea părului dorsal la 1 lună după ras a fost observată la șoareci de tip sălbatic (WT) (stânga), dar nu și la șoareci KO (dreapta). (B) Colorarea H&E a secțiunilor transversale ale pielii de la șoareci de tip sălbatic (WT) și KO de 10 săptămâni nu relevă diferențe morfologice între genotipuri. (SAT) Țesut adipos subcutanat. (C) Colorarea H&E a secțiunilor transversale ale pielii arată o reducere dramatică a SAT la șoarecii KO în vârstă de 40 de săptămâni.
Animalele Bmal1 -/- în vârstă de 40 de săptămâni demonstrează, de asemenea, o reducere a masei musculare și osoase dependente de vârstă (Fig. (Fig. 1D). 1D). Ambele fenomene (sarcopenia îmbătrânirii și osteoporoza) sunt semnele distinctive ale îmbătrânirii mamiferelor (Weiss și colab. 1991; Karakelides și Sreekumaran Nair 2005). Examenul histologic al secțiunilor transversale ale mușchiului cvadriceps femural a arătat că masa musculară redusă la animalele KO a fost asociată cu o scădere a numărului de fibre musculare și a diametrului acestora. Acest defect este dependent de vârstă, deoarece animalele în vârstă de 10 săptămâni nu prezintă diferențe în structura fibrelor musculare între genotipuri (Fig. (Fig. 1E 1E).
În plus față de grăsime, mușchi și os, masa mai multor organe majore (splină, rinichi, testicul, inimă și plămâni) a fost semnificativ redusă la animalele KO în vârstă de 40 de săptămâni (Fig. (Fig. 1D). 1D) . În același timp, nu au existat diferențe în mărimea stomacului, ficatului sau intestinului între genotipuri. La vârsta de 30 de săptămâni, numai splina a fost semnificativ mai mică în KO în comparație cu animalele de tip sălbatic (Fig. Suplimentar 2). Toate celelalte organe se aflau la limita inferioară a greutății lor normale. Examenul histologic al splinei și rinichilor KO nu a evidențiat nicio leziune degenerativă (datele nu sunt prezentate), sugerând că dimensiunea lor mai mică nu se datorează unui proces degenerativ acut, ci este mai degrabă o consecință a reducerii sistematice. Scăderea splinei, rinichilor și testiculului asociată vârstei a fost observată în timpul îmbătrânirii naturale, precum și în modelele animale de îmbătrânire accelerată (Arking 1998; Tyner și colab. 2002).