Flavivirus ARN Sinteza in vitro
Radhakrishnan Padmanabhan
1 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Școala de Medicină a Universității Georgetown, Washington DC 20057
Ratree Takhampunya
1 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Facultatea de Medicină a Universității Georgetown, Washington DC 20057
Tadahisa Teramoto
1 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Școala de Medicină a Universității Georgetown, Washington DC 20057
Kyung H. Choi
2 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Filiala Medicală a Universității din Texas, Galveston, TX 77555-0156
rezumat
Stabilirea sistemelor in vitro pentru studierea mecanismelor de sinteză a ARN-ului pentru virușii de ARN cu catenă pozitivă au fost foarte utile în trecut și au arătat lumina asupra compoziției proteinelor și a componentelor ARN, condiții optime, natura produselor formate, ARN cu acțiune cis elemente și factori proteici cu acțiune transă necesari pentru o sinteză eficientă. În această revizuire, rezumăm înțelegerea noastră actuală cu privire la cerințele pentru sinteza ARN-ului flavivirus in vitro. Descriem detalii despre condițiile de reacție, specificitatea șablonului utilizat fie de complexul de replicază virală legat de membrană cu mai multe componente, fie de ARN polimerază ARN dependentă recombinată purificată. De asemenea, discutăm perspective viitoare pentru a extinde limitele cunoștințelor noastre.
1. Introducere
1.1. ARN DENV
2. Sinteza ARN DENV in vitro folosind șabloane endogene de ARN viral în complexe de replicare legate de membrană
2.1. Introducere
Flavivirusurile au o gamă largă de gazde și se pot reproduce într-o varietate de celule de mamifere și țânțari. S-a raportat că, deși alphavirusul, virusul Sindbis, poate reproduce și produce antigeni specifici virusului în celulele embioase de pui enucleate, virusul encefalitei japoneze (JEV) nu a putut să producă acest lucru și implicarea nucleară timp de cel puțin 2-4 ore după infecție pentru a fost necesară sinteza antigenului specific virusului [38]. Rolul nucleului pentru această cerință nu este înțeles.
Membranele reticulului endoplasmatic (ER) sunt implicate intim în traducere și replicarea virală în citoplasmă. De fapt, studiile folosind microscopia electronică și metodele de tomografie electronică tridimensională au arătat că replicarea virală are loc în complexele de replicare legate de membrană în compartimentele de membrană ER induse de virus și extinse [39, 40]. Complexele de replicare legate de membrană de la celule infectate cu flavivirus au fost analizate pentru compoziția speciilor de ARN viral de mai multe grupuri. ARN de dimensiune genomică de 40-44S are capac de tip 1 la capătul 5 ′, dar nu are poli (A) la capătul 3 ′ [1, 41-44]. În plus, s-au observat, de asemenea, ARN dublu catenar de 20-22S și ARN heterogen 20-28S probabil replicativă (RF) și intermediară replicativă (RI) [45-48], precum și ARN-uri mai mici de 8-12S ARN în flavivirus -celule infectate [1]. S-a ajuns la concluzia că aceste specii mici de ARN erau produsele de degradare ale ARN-urilor virale [49] întrucât s-a raportat că nu există dovezi pentru activitatea șablonului unui ARN mic într-un studiu anterior [1]. În lumina cunoștințelor actuale, speciile mici de ARN ar putea include probabil ARN-ul subgenomic despre care s-a raportat că este o degradare incompletă a ARN-ului genomic viral de către ARN-urile celulare [50]. Acest ARN mic s-a dovedit a fi esențial pentru citopaticitatea și patogenitatea WNV [50, 51].
2.2. Primele sisteme de studiu a replicării virale in vitro
Noțiunea că membranele celulare au jucat un rol important în ciclul de viață al virusului ARN (+) catena, inclusiv în replicare, a fost cunoscută cel puțin de la sfârșitul anilor 1960 până la începutul anilor 1970 [52, 53]. De exemplu, sinteza ARN picornavirală este inițiată în fracțiune membranară netedă cu o valoare de sedimentare de 130 S în centrifugarea cu gradient de densitate izopicnică a zaharozei, care apoi se maturizează într-un complex de replicare tardivă a structurilor de 250 S. Complexul de replicare a constat din ARN polimerază virală, ARNs, forma replicativă (RF) 20 S și 26 S și forma intermediară replicativă (RI) a ARN viral, respectiv [53, 54]. În studiile anterioare, complexul de replicare endogen legat de membrană a fost caracterizat prin sinteza ARN virală de către Qureshi și Trent folosind celule BHK-21 infectate cu virusul encefalitei Saint Louis (SLE) [55] și de Zebovitz și colab. folosind celulele renale porcine infectate cu JEV, PS (Y-15) [47, 48]. Pentru a caracteriza speciile de ARN din structurile de membrană citoplasmatică care sedimentează la 250 S, celulele BHK-21 infectate cu LES în prezența actinomicinei au fost marcate cu puls cu uridină marcată cu [3H] timp de 30 de minute la 16 ore după infecție [ 55]. Structurile de membrană 250 S, care conțineau