Filme subțiri ADN-platină pentru utilizare în studiile de chimioterapie

Mohammad Rezaee

Grup în științe radiaționale, Departamentul de Medicină Nucleară și Radiobiologie, Facultatea de Medicină și Științe ale Sănătății, Universitatea Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canada J1H5N4

Elahe Alizadeh

Darel Hunting

Léon Sanche

Abstract

1. Introducere

10 nm) de LEE în materie biologică, astfel de studii trebuie efectuate pe pelicule ADN foarte subțiri de grosime similară. Filmele subțiri Pt-ADN ar putea oferi o abordare experimentală pentru a investiga efectele directe ale electronilor secundari și ale altor particule cu rază scurtă de acțiune (sau specii secundare) asupra ADN-ului în prezența compușilor Pt. Astfel de investigații ar putea dezvălui mecanisme care stau la baza efectului sinergic dintre radiații și medicament, care pot avea implicații pentru optimizarea protocoalelor în CRT, precum și în proiectarea și dezvoltarea de noi medicamente chimioterapeutice și radiosensibilizante [14].

Compușii Pt precum cisplatina și carboplatina se leagă de atomul N7 al bazelor purinice și produc aducti Pt-ADN incluzând în principal legături încrucișate intrastrand, legături încrucișate interstrand și legare monofuncțională la guanină [24]. Aductii distorsionează conformația ADN și reduc stabilitatea structurală a ADN-ului [24, 25]. Mai mult, ADN-ul trebuie să tolereze condițiile de incubație necesare pentru a reacționa cu compușii Pt. În majoritatea studiilor in vitro, o soluție de ADN este amestecată cu o soluție de compuși Pt la 37 ° C timp de 24 sau 48 de ore [26-30]. Aceste condiții afectează integritatea ADN-ului ca urmare a proceselor de depurinare și oxidare [31]. Pentru a maximiza cantitatea de compuși Pt legați de ADN păstrând ADN-ul intact, toți parametrii implicați în prepararea filmelor trebuie cunoscuți și controlați cu atenție. În special, trebuie determinate condițiile experimentale pentru reacția compușilor Pt cu ADN, precum și efectul legării chimice a compușilor Pt asupra stabilității ADN-ului.

În studiul de față, investigăm parametrii compușilor Pt și reacțiile de platinare asupra integrității ADN-ului în prepararea filmelor de cisplatină/ADN și carboplatină/ADN. Condițiile experimentale optime sunt determinate să păstreze o proporție ridicată a formei supraînfășurate de ADN plasmidic în filmele Pt-ADN.

2. Secțiunea experimentală

2.1. Prepararea ADN-ului plasmidic

ADN-ul plasmidic (pGEM-3Zf (-), 3197 perechi de baze, aproximativ 1968966 amu per plasmidă) a fost extras din Escherichia coli JM109 și purificat cu un kit de plasmidă HiSpeed Maxi (QIAGEN) [32]. ADN-ul plasmidic purificat a constat din 96% forme supraînfășurate, 2% cancatemeric și 2% forme circulare tăiate. Concentrația de ADN și cantitatea relativă de proteine din soluția de ADN plasmidic a fost apoi calculată prin măsurarea raportului de absorbție ultravioletă (UV) a ADN-ului și a proteinelor la 260 nm și, respectiv, 280 nm, cu un spectrofotometru Synergy HT-I. Raportul a fost de 1,98, ceea ce corespunde unei purități mai mari de 85% [33]. Tamponul TE (Tris-EDTA: 10 mM - 1 mM) a fost separat de ADN prin filtrare pe gel cu un mediu Sephadex G-50 [34]. Astfel, soluția finală a constat din ADN și ddH2O după filtrare. Pentru a evalua efectul Tris asupra legării compușilor Pt de ADN, au fost pregătite două grupuri diferite de soluții de ADN. În primul grup, tamponul Tris a fost adăugat la soluția de ADN la raportul unei molecule de tris pe nucleotidă, iar în al doilea grup, soluția de ADN a fost preparată numai cu ddH2O. Concentrația ADN a fost aceeași în ambele grupuri. În fiecare grup, probele de control au fost păstrate la temperatura de -20 ° C și cuantificate pentru analiza efectului temperaturii asupra ADN-ului.

2.2. Platinarea ADN-ului plasmidic

2.3. Analiza legării ADN-platină

Concentrația de platină în soluții a fost măsurată prin spectroscopie de masă plasmatică cuplată inductiv Elan DRC II (ICPMS, de la Perkin Elmer) care a fost utilizată ca metodă adecvată pentru măsurarea platinei în multe aplicații biomedicale [37, 38]. În plus, trei probe martor constând din compuși Pt dizolvați în ddH2O la concentrații cunoscute au fost, de asemenea, pregătite pentru calibrarea măsurătorilor ICPMS ale probelor Pt-ADN. Concentrația ADN a fost măsurată prin spectrofotometrie. S-a determinat din densitatea optică a ADN-ului în soluție măsurată prin absorbția UV la o lungime de undă de 260 nm. Concentrația de ADN a fost calculată din densitatea optică de referință.

2.4. Prepararea filmelor de substrat, ADN și Pt-ADN

2.5. Cuantificarea ADN și a filmelor Pt-ADN

2.6. Analize statistice

Software-ul OriginPro 8.1 SR1 (OriginLab Corporation) a fost utilizat pentru analize statistice și matematice. Testul t asociat a fost testul statistic în care o probabilitate de 0,05 (5%) a fost considerată semnificativă.