Factorul oțel controlează supraviețuirea și motilitatea celulelor germinale primordiale din momentul lor
rezumat
INTRODUCERE
MATERIALE ȘI METODE
Creșterea șoarecilor, pregătirea embrionilor și genotiparea
Cultura feliei de embrioni
Embrionii E7.25 și E7.5 au fost tăiați în jumătăți de-a lungul axei sagittale folosind un bisturiu. O jumătate din fiecare embrion a fost plasată pe un insert de cultură de organe CM millicel (Millipore) pre-acoperit cu colagen IV (BD) și cealaltă jumătate a fost utilizată pentru genotipare. Pentru embrioni E9.0, jumătățile caudale au fost cultivate pe inserții așa cum s-a descris anterior (Molyneaux și colab., 2001). Inserțiile de organe millicell au fost apoi plasate într-o etapă metalică care conținea camere cu fund de sticlă și incubate în 600 μl tampon Hepes mediu DMEM/F-12 (Gibco) cu 0,04% BSA fără lipide și 100 U/ml penicilină/streptomicină (Gibco). Pentru a genera o pierdere acută de semnalizare a oțelului, 10 μg/ml anticorp de blocare c-Kit, Ack2 (un cadou bun de la Dr. Fred Finkelman, CCHMC), a fost adăugat la mediul de cultură felie. Șoarece IgG (10 μg/ml, Jackson ImmunoResearch) a fost utilizat ca control. Feliile de embrioni au fost menținute la 37 ° C prin plasarea etapei metalice într-o etapă cu temperatură controlată (Zeiss) și menținerea umidității cu prosoape de hârtie umede plasate într-un vas de cultură de 100 mm fixat peste camerele de cultură a organelor.
Analiza time-lapse a PGC-urilor migratoare
Feliile au fost filmate cu un sistem confocal Zeiss LSM510 atașat la un microscop axiovert Zeiss. Imaginile au fost achiziționate la fiecare 5 minute timp de 6 până la 10 ore, iar filmele au fost analizate folosind imaginea NIH așa cum este descris (Molyneaux și colab., 2001). Pe scurt, toate celulele care au rămas focalizate pe durata filmării au fost urmărite, iar viteza medie, viteza maximă și deplasarea au fost măsurate pentru fiecare dintre aceste celule utilizând două macro-uri de urmărire a celulelor scrise pentru software-ul NIH ImageJ de Kathy Molyneaux sau de Erik Meijering. Direcționalitatea lor a fost, de asemenea, înregistrată, iar traiectoria netă pentru toate celulele din fiecare embrion a fost trasată pe o diagramă de vânt. Experimentele s-au repetat de cel puțin trei ori și s-au analizat trei până la opt embrioni pe grup. Pentru comparații statistice, datele au fost analizate folosind un test t al Studentului cu două cozi, fără perechi, cu varianțe egale.
RT-PCR
Pentru analiza RT-PCR, alantoidele de la embrioni E7.5 și crestele genitale de la embrioni E10.5 au fost disecate, iar ARN-ul extras din țesuturile disecate folosind RNeasy Kit (Qiagen). ARN (10 ng) a fost transcris invers utilizând sistemele de sinteză First-Strand Superscript III (Invitrogen), urmând recomandările producătorului. Reacțiile PCR au fost efectuate folosind Redmix Plus (GeneChoice). Exemplele utilizate au fost după cum urmează: factor de oțel legat de membrană, F-5'-TCCCGAGAAAGGGAAAGC-3 ', R-5'-CTGCCCTTGTAAGACTTGACTG-3' (lungimea fragmentului prevăzut, 149 bp); factor de oțel solubil, F-5'-TTATGTTACCCCCTGTTGCAG-3 ', R-5'-CTGCCCTTGTAAGACTTGACTG-3' (lungimea fragmentului prevăzut, 195 bp).
Analiza imunofluorescenței pe embrioni montați întregi sau secțiuni înghețate
Embrionii au fost fixați în 4% paraformaldehidă (PFA). Pentru colorarea în întregime, embrionii au fost apoi spălați în 0,5% NP-40 (2 × 10 minute), blocați în PBSST (PBS/0,3% Triton X-100 cu 5% ser de capră sau măgar, 2 × 1 oră de spălare) și incubat peste noapte la 4 ° C în PBSST cu anticorp primar. A doua zi, embrionii au fost spălați în PBST (PBS/0,3% Triton X-100, 2 × 15 minute, apoi 3 × 1 oră) la 4 ° C, incubate peste noapte la 4 ° C în PBSST cu Cy3- sau Cy5- anticorpi secundari conjugați (Jackson ImmunoResearch), spălat în PBST (2 × 15 minute, apoi 3 × 1 oră) și eliminat în 50%, apoi 90%, glicerol pentru imagistică. Embrionii care trebuie secționați au fost deshidratați în zaharoză și montați în compus OCT (Tissue-Tek) pentru criosecționare. Embrionii secționați au fost rehidratați cu PBST (10 minute), blocați cu PBSST (1 oră la temperatura camerei) și incubați cu anticorp primar peste noapte la 4 ° C. A doua zi, lamele au fost spălate cu PBST (3 × 15 minute), incubate în PBSST cu anticorp secundar (2 ore), spălate cu PBST (2 × 15 minute) și montate cu DABCO (Sigma) pentru imagistică.
REZULTATE
Factorul de oțel este exprimat de celulele care înconjoară PGC-uri pe tot parcursul migrării
Așa cum se arată în FIG. 1B, C, factorul de oțel localizat cu membrană celulară a fost văzut în alantoidă la E7.5. Pentru a confirma prezența factorului de oțel legat de membrană în alantoidă, am fixat embrioni E7.5 cu acid tricloracetic 2% (TCA), ceea ce a dat o reacție încrucișată mai bună cu anticorpul anti-factor de oțel. Fixarea TCA determină pierderea semnalului GFP, astfel încât PGC-urile nu au putut fi identificate. Cu toate acestea, un grup de celule din miezul alantoidei a arătat o colorare puternică a membranei a factorului Steel (Fig. 1J, săgeată). De asemenea, am disecat alantoidele din embrioni E7.5 și am efectuat RT-PCR folosind primerii care disting factorii de oțel legați de membrană și solubili. Rezultatele RT-PCR au confirmat prezența factorului de oțel atât solubil, cât și legat de membrană în alantoidă la E7.5 (Fig. 1K).
PGC exprimă mai întâi Stella în alantoida extraembrionară și migrează proximal în epiblastul posterior
Cadre time-lapse de embrioni E7.25 și E7.5 Stella-GFP. (A) Trei cadre la t = 0, t = 78 minute și t = 156 minute ale unui film au început la E7.25. La t = 0, PGC-urile, detectate prin expresia Stella (verde), sunt vizibile în alantoidă (AL). Expresia reziduală a Stella este, de asemenea, văzută în altă parte a embrionului. PGC-urile încep să se răspândească în jos către epiblast. Săgeata indică granița aproximativă între alantoidă și epiblastul proximal. () Trei cadre la t = 0, t = 280 minute și t = 560 minute ale unui film au început la E7.5. PGC se deplasează de la alantoidă în epiblastul posterior al embrionului în timpul perioadei de film. Săgeata indică granița aproximativă între alantoidă și epiblastul proximal. Populația PGC se extinde în epiblast proximal. Barele de scară: 100 μm.
Lucrările recente din laboratorul nostru au arătat că pierderea factorului Steel duce la apoptoza PGC începând cu sau înainte de E9.0, care poate fi salvată prin îndepărtarea proteinei pro-apoptotice Bax (Runyan și colab., 2006). Prin urmare, am examinat embrioni din cruci de oțel/Bax la E7.5. În cinci embrioni Bax +/-, din oțel -/- examinați, pierderea unei alele de Bax a salvat scăderea numărului de PGC în embrioni din oțel -/- la E7.5 (Fig. 3A). La embrionii din oțel -/-, numărul PGC a crescut de la 15 ± 4,3 la 29 ± 9,3 (P = 0,041) în absența unei alele a lui Bax. Exemple de embrioni din care s-au făcut aceste numărări sunt prezentate în Fig. 3B. Aceste date arată că factorul Oțel este un factor esențial de supraviețuire pentru PGC chiar înainte de a intra în intestin și că PGC mor prin calea apoptotică dependentă de Bax la E7.5 atunci când nu au factor Oțel. Datele exclud, de asemenea, posibilitatea ca factorul de oțel să fie necesar pentru specificațiile PGC inițiale, deoarece numărul de PGC a crescut la embrionii Oțel-nul atunci când apoptoza a fost inhibată.