Extinderea vieții în Drosophila prin hrănirea unui medicament PNAS

Contribuție de Seymour Benzer

Abstract

Raportăm că hrănirea Drosophila pe tot parcursul maturității cu 4-fenilbutirat (PBA) poate crește semnificativ durata de viață, fără a diminua vigoarea locomotorie, rezistența la stres sau capacitatea de reproducere. Tratamentul pentru o perioadă limitată, fie devreme, fie târziu în viața adultă, este, de asemenea, eficient. Muștele hrănite cu PBA arată o creștere globală a acetilării histonelor, precum și un model dramatic modificat de exprimare a genelor, inclusiv inducerea sau reprimarea a numeroase gene. Întârzierea îmbătrânirii poate rezulta din starea fiziologică modificată.

Îmbătrânirea este un fenomen biologic comun împărtășit de animale și plante (1), dar înțelegerea noastră de ce și cum îmbătrânim rămâne limitată. Ar fi de mare interes biologic și de importanță practică dacă am putea obține o perspectivă asupra bazei moleculare a îmbătrânirii, să învățăm să întârzie procesul de îmbătrânire și să menținem vigoarea tinerilor.

Studii recente arată că longevitatea poate fi modificată prin manipulări genetice la diferite organisme. Mutațiile de vârstă-1 (2), daf-2 (3, 4) și clk-1 (5) în Caenorhabditis elegans cresc longevitatea viermelui. În drojdie, genele Sir extind durata de viață a celulei mamă în devenire (6). Durata de viață a drosofilei este crescută de mutații ale unui receptor cuplat cu proteina G din Metuselah (7), un cotransportor de dicarboxilat de sodiu în Indy (8), un substrat al receptorului de insulină în chico (9) sau un receptor asemănător insulinei în InR (10) . Studiile cu Drosophila prin metode transgenice au fost recent revizuite (11). Evident, este de mare interes să descoperiți medicamente care pot prelungi durata de viață printr-o simplă hrănire. S-a demonstrat că mimeticele superoxidului dismutază și catalazei prelungesc durata de viață în C. elegans (12). În timp ce studiem mecanismul acțiunii medicamentului asupra mutanților neurodegenerativi (13), am descoperit că 4-fenilbutiratul de sodiu (PBA) poate crește atât durata mediană, cât și durata maximă de viață a Drosophila.

Prezentăm mai jos constatarea extinderii duratei de viață în Drosophila prin hrănirea PBA, împreună cu date despre modificările în acetilarea histonei și spectrul genelor induse și suprimate de PBA.

Materiale și metode

Tulpini de muște și fenilbutirat.

Au fost utilizate tulpinile Drosophila w 1118 și Canton-S de tip sălbatic. Acidul PBA, sarea de sodiu, a fost un dar generos de la Joseph Cooper din Medicis, Scottsdale, AZ. Puritatea substanței chimice a fost raportată a fi de 99,6%.

Determinarea duratei de viață.

Muștele nou închise au fost colectate și crescute în mediu agar de porumb standard (28). Pentru fiecare experiment, 10 flacoane, fiecare conținând 20 de muște, au fost menținute fie la 29 ° C, fie la 25 ° C și au fost transferate în flacoane proaspete la fiecare 3 zile. Numărul muștelor moarte a fost numărat în fiecare zi.

Hibridizarea membranei.

Kitul inteligent de sinteză ADNc PCR (CLONTECH) a fost utilizat pentru sintetizarea sondelor pentru hibridizare. ARN-ul total a fost preparat din muște hrănite timp de 10 zile la 29 ° C cu mediu conținând 10 mM PBA sau cu mediu simplu. După sinteza catenelor de ADNc de către Maloney Murine Leucemia Murine (MMLV) -verscriptază inversă, ADNc a fost amplificat prin PCR, reacția constând din 95 ° C timp de 1 min, urmată de 24 de cicluri de 15 secunde la 95 ° C, 30 de secunde la 65 ° C și 6 min la 68 ° C. Probele au fost preparate printr-o metodă de etichetare a ADN-ului cu amorsare aleatorie cu [α- 32 P] dCTP. Filtrele conținând 7.500 de clone unice Drosophila EST (Research Genetics, Huntsville, AL) au fost prehibridizate timp de 4 ore, apoi s-au adăugat sonde pentru a hibridiza timp de 16 ore la 58 ° C într-un tampon conținând 1 M NaCl, 0,05 M Tris (pH 8,0), EDTA 5 mM, 1% SDS și 10% sulfat de dextran. După hibridizare, filtrele au fost spălate de mai multe ori și expuse la film cu raze X pentru a identifica genele care au fost induse sau reprimate de PBA.

Revers-Northern Blots.

Pentru modificări cantitative în abundența transcrierilor individuale, 00500 perechi de baze ale fiecărei gene candidate au fost sintetizate prin PCR și 100 ng au fost montate pe o membrană de transfer din nylon (hybond-N +, Amersham Pharmacia). Muștele adulte nou apărute au fost hrănite cu alimente standard cu muște care conțin 10 mM PBA, sau alimente simple, timp de 10 zile la 29 ° C. ARN Messenger a fost extras și utilizat pentru a sintetiza ADNc prin MMLV-transcriptază inversă, iar sondele au fost preparate prin amorsare aleatorie și [α- 32 P] dCTP. Membrana de nylon care conține gene candidate a fost hibridizată cu sonda preparată din muștele martor și expusă la un ecran PhosphorImager (Molecular Dynamics). După expunere, sonda a fost dezlipită în 10 mM EDTA/0,1% SDS la 80 ° C și expusă la un ecran PhosphorImager timp de 18 ore, pentru a confirma că nu a rămas nicio sondă reziduală. Membrana a fost apoi hibridizată din nou cu a doua sondă, preparată din muște hrănite cu PBA. Nivelul de expresie al fiecărei gene a fost cuantificat utilizând programul IMAGE QUANT (Molecular Dynamics).

Western Bloting of Histones.

Loturi de 100 de muște au fost folosite pentru a prepara histone (29). Omogenatele muștelor întregi au fost centrifugate la 2.500 × g timp de 10 minute într-un mediu conținând 0,05 M glicină, 10 mM maleat de potasiu Tris, 5 mM MgCl2 și 10 mM mercaptoetanol (pH 7,3) pentru a scăpa de resturile celulare. S-a adăugat HCl la supernatant la o concentrație finală de 0,25 M, care a fost menținută pe gheață timp de 1 oră. Proteinele solubile în acid au fost recuperate prin centrifugare la 13.000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C, apoi acidul tricloracetic (TCA) a fost adăugat la proteinele precipitate. Probele de zece micrograme de proteine au fost încărcate pe un gel de poliacrilamidă de 16,5% pentru electroforeză, apoi transferate într-o membrană poli (viniliden difluorură) (PVDF), urmată de hibridizare cu anticorpi împotriva H3 și H4 acetilate și nonacetilate, NY). Pentru a verifica dacă orice PBA rezidual din corpurile de muște nu ar afecta acetilarea histonelor în timpul purificării lor, am adăugat 30 mM PBA în tamponul de omogenizare înainte de izolarea nucleelor și histonelor și nu am găsit nicio diferență.

Rezultate si discutii

Pentru a testa acțiunea PBA in vivo, am hrănit cu muște nou închise ale tulpinii w 1118, pe tot parcursul vieții lor, cu mediu de muște standard (făină de porumb, agar, dextroză, drojdie; ref. 28) conținând diferite concentrații ale medicamentului (0, 0,1, 1, 2,5, 5, 10, 20 și 40 mM). Durata de viață a fost măsurată atât la 29 ° C, cât și la 25 ° C. Zece PBA milimolare au arătat o extensie izbitoare atât a medianei cât și a duratei maxime de viață (Fig. 1 a și c). La concentrațiile mai mari, 20 mM și 40 mM, PBA a fost aparent toxic, reducând supraviețuirea; există o gamă restrânsă de concentrație de PBA care este eficientă pentru extinderea duratei de viață. Pentru a determina dacă medicamentul este eficient și pe o tulpină diferită de Drosophila, am măsurat, de asemenea, efectul PBA asupra duratei de viață a tulpinei de tip sălbatic Canton-S (C-S), folosind 0, 2, 5 și 10 mM PBA. Cinci milimolari au crescut durata de viață la fel de mult ca 10 mM cu tulpina w 1118 (Fig. 1b), în timp ce 2 mM nu au avut efect și 10 mM au fost toxici. Astfel, concentrația optimă de PBA pare să varieze în funcție de fundalul genetic. Așa cum se arată mai jos, gradul de inhibare a histonei deacetilază a diferit, de asemenea, în același mod între aceste două tulpini.