Exprimarea factorului-1α inductibil de hipoxie în creierul șobolanilor în timpul hipoxiei cronice Journal of

Departamentele de anatomie și

Neurologie, Case Western Reserve University, Facultatea de Medicină, Cleveland, Ohio 44106

Abstract

Factorul-1 inductibil al hipoxiei (HIF-1) este un factor de transcripție care reglează răspunsurile adaptative la lipsa de oxigen din celulele mamiferelor. HIF-1 constă din două proteine, HIF-1α și HIF-1β. HIF-1α se acumulează în condiții hipoxice, în timp ce HIF-1β este exprimat constitutiv. Expresia HIF-1α și HIF-1β au fost măsurate în timpul adaptării la hipoxie hipobarică (0,5 atm) în cortexul cerebral de șobolan. Analizele Western blot au indicat faptul că HIF-1α s-a acumulat rapid în timpul debutului hipoxiei și nu a scăzut timp de 14 zile, dar a scăzut la normal cu 21 de zile, în ciuda tensiunii arteriale scăzute continue de oxigen. Imunomarcarea a arătat că neuronii, astrocitele, celulele ependimale și posibil celulele endoteliale au fost tipurile de celule care exprimă HIF-1α. Genele cu elemente sensibile la hipoxie au fost activate în aceste condiții, dovadă fiind factorul de creștere endotelial vascular crescut și nivelurile de ARNm transportor de glucoză-1. Când șobolanii adaptați de 21 de zile au fost expuși la o provocare hipoxică mai severă (8% oxigen), HIF-1α s-a acumulat din nou. Pe baza acestor rezultate, speculăm că remodelarea vasculară și modificările metabolice declanșate în timpul hipoxiei prelungite sunt capabile să restabilească nivelurile normale de oxigen tisular.

expunerea la un mediu cu conținut scăzut de oxigen declanșează mai multe mecanisme adaptative imediate și pe termen lung. La nivel sistemic, acestea includ hiperventilația și policitemia, care îmbunătățesc livrarea oxigenului către organele critice, cum ar fi creierul (15, 20). Cu toate acestea, aceste mecanisme compensatorii nu sunt suficiente pentru a satisface cererea de oxigen a sistemului nervos central, în special în timpul expunerii prelungite la hipoxie. Creierul prezintă o remarcabilă capacitate de răspuns structural și metabolic la hipoxia prelungită. Unul dintre cele mai dramatice răspunsuri structurale este remodelarea considerabilă a rețelei microvasculare cerebrale. Studiile anterioare au arătat că 3 săptămâni de expunere la hipoxie hipobarică au determinat o creștere semnificativă a densității microvaselului în tot creierul (2, 9, 15,19). Această plasticitate structurală este, de asemenea, însoțită de adaptarea metabolică la tensiunea scăzută a oxigenului. De exemplu, creșterea transportului glucozei (7), creșterea ratei metabolice cerebrale a glucozei (10) și a activității citocrom oxidazei (4.14) au fost raportate în creierul șobolanilor după 3 săptămâni de expunere la hipoxie hipobarică.

În timpul expunerii prelungite la hipoxie, HIF-1α trebuie exprimat atâta timp cât echilibrul dintre aportul de oxigen și utilizarea în țesut nu a fost atins. Rezultatele noastre au arătat că nivelurile de HIF-1α revin la valorile normoxice după 3 săptămâni de hipoxie, sugerând că remodelarea vasculară cerebrală și modificările metabolice au fost capabile să compenseze hipoxia țesutului cerebral.

Expunerea la hipoxie cronică.

Șobolanii masculi Wistar cu vârsta de 2-3 luni au fost păstrați până la 3 săptămâni în camere hipobarice menținute la o presiune de 380 Torr (0,5 atm, echivalent cu 10% oxigen normobaric). În grupuri păstrate timp de> 1 zi, camerele au fost deschise 30 de minute în fiecare zi pentru curățarea coliviei și alimentarea cu alimente și apă. Durata hipoxiei a fost de 6 ore, 12 ore sau 1, 4, 7, 14 sau 21 de zile. Fiecare grup experimental de șobolani a avut propriul grup de control al coechipierului, care a fost ținut în afara camerelor hipobarice, dar în aceeași locație. Un grup de șobolani păstrați timp de 21 de zile în camera hipobarică a fost în continuare expus fie la 10%, fie la 8% oxigen normobaric timp de 4 ore imediat după ce a fost îndepărtat din camera hipobarică. Probele de sânge venos din coadă au fost obținute pentru determinarea hematocritului înainte ca șobolanii să fie uciși.

Analiza Western blot.

După expunerea hipoxică, șobolanii experimentali și de control au fost uciși, iar creierul lor a fost îndepărtat rapid și înghețat în azot lichid. Probele corticale au fost disecate și omogenizate în tampon rece cu gheață (20 mM HEPES, pH 7,5, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,1 M NaCl) suplimentat cu 0,2 mM ditiotreitol, 0,5 mM vanadat de sodiu și inhibitori de protează (0,4 mM fluorură de fenilmetilsulfonil și 2 μg/ml fiecare de leupeptină, pepstatin și aprotinin). Ulterior, s-a adăugat NaCI la o concentrație finală de 0,45 M, iar omogenatul a fost centrifugat la 10.000 g timp de 30 min. Supernatantele au fost colectate și amestecate cu un volum egal de tampon de omogenizare conținând 40% (vol/vol) glicerol înainte de a fi depozitate la -80 ° C. Probele (total de 200 μg de lizat) au fost supuse electroforezei în gel de poliacrilamidă SDS-7% și transferate în membranele de nitroceluloză prin proceduri standard.

Membranele au fost blocate cu lapte praf degresat 5% și incubate timp de 2 ore la temperatura camerei cu următorii anticorpi: anti-HIF-1α monoclonal (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO), anti-HIF-1β policlonal (1: 1.000, Novus Biologicals) și anti-VEGF policlonal (1: 400, Santa Cruz Biotech, Palo Alto, CA). Aceasta a fost urmată de incubare cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean și detectare îmbunătățită a chemiluminescenței (ECL, Amersham, Piscataway, NJ). Extractele nucleare brute ale celulelor Hepa 1 (American Type Culture Collection, CRL-1830) expuse la 1% sau 20% oxigen au fost utilizate ca martori pozitivi (30 μg de proteine) în analizele Western blot. Concentrațiile de proteine au fost determinate prin testul proteinei Bradford (Bio-Rad).

Extracția ARN și analiza Northern blot.

ARN-ul total a fost extras din cortexul cerebral folosind sistemul de izolare a ARNgentilor (Promega, Madison, WI) conform instrucțiunilor producătorului. Eșantioane egale (10 μg) de ARN total au fost electroforezate în 1% geluri de agaroză-formaldehidă, transferate în membrane de nailon (Millipore, Bedford, MA), reticulate cu ultraviolete și hibridizate cu sonde primare aleatorii. Bloturile au fost hibridizate cu soluție Quickhyb (Stratagene, La Jolla, CA) și spălate în 0,2 × citrat de sodiu salin, 0,1% SDS la 55 ° C. Sondele VEGF și GLUT-1 au fost achiziționate de la Research Genetics (numerele de acces GenBank AA154722 și respectiv AA451073), iar sonda oligonucleotidică pentru ARN 18S a fost obținută de la Life Technologies (Rockville, MD).

Imunohistochimie HIF-1α.

Șobolanii normoxici și hipoxici (4 și 21 de zile de hipoxie) au fost profund anesteziați cu Nembutal și perfuzați intracardic cu soluție salină tamponată cu fosfat rece cu gheață (pH 7,4) urmată de paraformaldehidă tamponată cu fosfat 4%. Creierele au fost îndepărtate și postfixate în paraformaldehidă 2% timp de 24 de ore și încorporate în parafină. Secțiunile seriale (6 μm) au fost tăiate pe un microtom, montate pe lamele acoperite cu gelatină, uscate la aer și depozitate la temperatura camerei până când au fost procesate pentru imunohistochimie. Pentru a identifica unele dintre celulele care exprimă HIF-1α, s-a efectuat o imunomarcare dublă utilizând doi markeri celulari, antigen specific nucleului neuronal (NeuN) și proteină acidă fibrilară glială (GFAP). Pe scurt, secțiunile au fost deparafinizate, hidratate și supuse recuperării antigenului la 90 ° C timp de 25 de minute folosind soluția Target de recuperare (Dako, Carpinteria, CA), conform instrucțiunilor producătorului. Anticorpul monoclonal de șoarece împotriva HIF-1α (1: 200, Novus Biologicals) a fost detectat prin utilizarea unui sistem de streptavidină-biotină-hrean peroxidază (sistem de amplificare a semnalului catalizat, Dako). Anti-GFAP monoclonal (1: 500, Sigma Chemical) și anti-NeuN (1: 500, Chemicon, Temecula, CA) au fost detectate folosind anticorpi secundari Texas roșu și, respectiv, fluorescenți conjugați (Vector, Burlingame, CA).