Emulgatorii alimentari modifică direct compoziția microbiotei umane și expresia genei ex vivo
Bolile inflamatorii cronice sunt asociate cu modificări ale speciei și compoziției genomice a microbiotei intestinale.
Emulsifianții dietetici polisorbat 80 (P80) și consumul de carboximetilceluloză (CMC) are ca rezultat intrarea microbiotei în mucus, modificări ale compoziției microbiotei și dezvoltarea inflamației cronice.
Inflamația în sine poate avea un impact asupra compoziției microbiotei, ceea ce face foarte dificilă discernerea măsurii în care acești compuși acționează direct asupra microbiotei față de promovarea inflamației gazdei, care ulterior se remodelează.
Care sunt noile descoperiri?
CMC și P80 nu au impact asupra microbiotei intestinale și nici asupra gazdei la șoareci care adăpostesc o microbiotă fără patobionți.
Utilizarea simulatorului de mucoasă al ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME) relevă faptul că atât P80 cât și CMC modifică direct microbiota, crescând potențialul său proinflamator.
Când sunt transplantate la șoareci fără germeni, suspensiile M-SHIME tratate cu CMC și tratate cu P80 promovează fenotipuri asociate inflamației de grad scăzut care indică faptul că efectele directe ale acestor emulgatori asupra microbiotei sunt suficiente pentru a determina inflamația de grad scăzut și boala metabolică.
Cum ar putea avea impact asupra practicii clinice în viitorul previzibil?
Observația că emulgatorii CMC și P80 au un impact direct asupra microbiomilor umani într-o manieră care amintește de efectele lor la șoareci susține utilizarea acestui model ca mijloc practic de testare a siguranței aditivilor alimentari.
Rezultatele noastre demonstrează utilitatea sistemului M-SHIME ca instrument de explorare a mecanismelor de bază ale oricăror modificări ale gazdei/microbiotei.
Introducere
Prin urmare, obiectivul central al acestui studiu a fost de a investiga măsura în care CMC și P80 ar putea modifica direct microbiota folosind un simulator de mucoasă al modelului ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME), care permite menținerea stabilă a unei microbiote umane complexe în in vitro în absența celulelor gazdă.13-16 Am observat că P80 și CMC au modificat microbiota în modelul M-SHIME într-un mod care amintește și este capabil să recapituleze efectele lor observate anterior la șoareci, sugerând astfel că microbiota poate fi o țintă directă cheie a CMC și P80.
Metode
Șoarecii C57BL/6 au fost menținuți în condiții gnotobiotice într-o stare GF sau alterată a florei Schaedler (ASF) într-un izolator Park Bioservices, așa cum s-a descris anterior. locuințe. Toți șoarecii au fost crescuți și adăpostiți la Georgia State University (Atlanta, Georgia, SUA) în conformitate cu protocoale aprobate instituțional (IACUC # A14033). Șoarecii au fost hrăniți cu LabDiet Rodent Chow # 5021 autoclav sau au o dietă bogată în grăsimi purificată iradiată (20-40 kGy) D12492-1.5V de la Research Diet (New Brunswick, New Jersey, SUA) (vezi tabelul suplimentar S1 online). Experimentele au folosit atât șoareci masculi, cât și femele (comparații la un sex), cu excepția figurilor 7 și 8 care au folosit șoareci femele. Șoarecii ASF au fost stabiliți prin colonizarea șoarecilor WT C57BL/6 GF cu ASF complet (opt tulpini) folosind fecale cumpărate de la ASF Taconic (Hudson, New York, SUA) și resuspendate în apă potabilă.
tabel suplimentar
Măsurarea glicemiei la jeun
Șoarecii au fost așezați într-o cușcă curată și au postit timp de 5 ore sau 15 ore. Concentrația de glucoză din sânge a fost apoi determinată folosind un glucometru Nova Max Plus și exprimată în mg/dL.
Tratamentul emulgator al sistemului M-SHIME
Analiza metatranscriptomică M-SHIME
Transplant de microbiota a suspensiei M-SHIME tratate cu emulgator
Simulatorul de mucoasă tratat cu carboximetilceluloză (CMC) și tratat cu P80 al ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME) suspensiile promovează încălcarea microbiotei atunci când este transplantat la șoareci receptori fără germeni. Un sistem M-SHIME cu opt nave a fost creat și inoculat cu fecale umane proaspete în ziua −7. După o perioadă de stabilizare de 7 zile, vasele au fost tratate cu apă, CMC 1% sau P80 1% timp de 13 zile. Șoarecii C57BL/6 fără germeni (vârsta de 3-4 săptămâni) au fost îndepărtați din izolator și au fost administrați oral cu 200 μL de suspensie luminală M-SHIME (probă de ziua 11). Șoarecii transplantați au fost apoi adăpostiți în cuști izolate ventilate, Isocages (Techniplast). (A) Analiza microscopică confocală a localizării microbiotei: Muc2 (verde), actină (violet), bacterii (roșu) și ADN (albastru). Bară = 20 μm. (B) Distanțele dintre cele mai apropiate bacterii de celulele epiteliale intestinale (IEC) pe afecțiune pe trei câmpuri de mare putere pe șoarece. Datele sunt mijloacele ± SEM (N = 5). Fiecare grup de tratament a fost comparat cu grupul de control (tratat cu apă), iar semnificația statistică a fost determinată folosind testul t Student.
analize statistice
Distribuția normală a datelor a fost evaluată folosind testul omnibus D'Agostino-Pearson. Semnificația a fost determinată utilizând testul t sau analiza de varianță a grupului bidirecțional (ANOVA) cu testul de comparații multiple al lui Bonferroni (software GraphPad Prism, V.6.01). Diferențele au fost observate ca semnificative * p≤0,05 pentru testul t și # p≤0,05 pentru ANOVA cu două căi. Pentru analiza grupării pe graficele principale de coordonate, categoriile au fost comparate, iar semnificația statistică a clusterizării a fost determinată prin Permanova.
Rezultate
CMC și P80 nu afectează microbiota intestinală sau gazda la șoarecii ASF
Pentru a investiga măsura în care CMC și P80 ar putea avea impact asupra gazdei și/sau microbiotei la șoareci cu o microbiotă definită limitată fără patobionți, am administrat CMC și P80 șoarecilor colonizați exclusiv cu ASF. Așa cum se arată în figurile 1 și 2, nici CMC și nici P80 nu au avut un impact semnificativ asupra unei game de parametri gazdă sau microbieni la șoareci ASF. Pe scurt, indiferent dacă a fost evaluat la nivel global prin analiza coordonatelor principale sau prin compararea speciilor individuale (Tabelul 1), testarea nivelurilor relative ale celor opt componente ASF prin q-PCR a indicat faptul că nici CMC și nici P80 nu au afectat compoziția microbiotei șoarecilor ASF și nici nu au modificat nivelurile fecale ale receptorilor Toll-like (TLR) -agoniști LPS și flagelină (figurile 1 și 2). Mai mult, la șoareci ASF, administrarea CMC și P80 nu a dus la atingerea microbiotei (figura 2L, M), subțierea mucusului sau caracteristici ale inflamației/sindromului metabolic de grad scăzut care sunt induse de acești compuși la șoarecii cu o microbiotă complexă., aceste rezultate argumentează împotriva noțiunii că acești emulgatori au un efect direct puternic asupra gazdei și sugerează mai degrabă posibilitatea ca efecte mai subtile asupra unei microbiote complexe să fie mediatori proximali ai efectelor acestor compuși.
Carboximetilceluloza (CMC) și P80 nu au impact asupra compoziției microbiotei intestinale la șoarecii alterați din flora Schaedler (ASF). Șoarecii ASF C57BL/6 de șase săptămâni au fost expuși la CMC sau P80 diluați în apă potabilă (1,0%) timp de 11 săptămâni. (A - I) ADN-ul fecal total a fost extras și supus q-PCR folosind primerii specifici pentru 16S rARN (A), Clostridium sp. (ASF 356) (B), Lactobacillus intestinalis (C), Lactobacillus murinus (D), Mucispirillum schaedleri (E), Eubacterium plexicaudatum (F), Firmicutes bacterium (G), Clostridium sp. (ASF 502) (H) și Parabacteroides sp. (Eu). Rezultatele sunt exprimate ca număr de bacterii pe mg de scaun (A), utilizând o curbă standard sau ca valori relative (B - I). (J - M) Analiza coordonatelor principale a fost efectuată utilizând distanța euclidiană cu cei opt membri ASF în săptămâna 6 (J), săptămâna 8 (K), săptămâna 10 (L) și săptămâna 17 (M). Datele sunt mijloacele ± SEM (N = 3-6). Pentru analiza clusterelor pe graficele principale de coordonate, categoriile au fost comparate și semnificația statistică a clusterizării a fost determinată folosind metoda Perman.