Efectul excitator coordonat al interneuronilor GABAergic asupra celor trei programe motorii de alimentare în
Abstract
Orice comportament complex necesită o coordonare specifică între diferite rețele neuronale care controlează diferitele sale aspecte pentru a obține o ieșire comportamentală semnificativă. O astfel de coordonare asigură producția ordonată a unui comportament complex și reprezintă un principiu universal al funcționării SNC atât la animale vertebrate, cât și la animale nevertebrate. Studiul actual se concentrează asupra comportamentului hrănitor al moluștei pteropode carnivore Clione limacina și mecanismele neuronale de coordonare între principalele elemente ale acestui comportament complex.
Descriem în acest studiu și discutăm rolul unei interneuron cerebrale simetric bilateral, desemnată celulă Cr-BM, care produce o influență excitativă proeminentă asupra tuturor rețelelor neuronale care controlează trei structuri majore de hrănire în Clione: conuri bucale, cârlige chitinoase și radulă. O descriere generală preliminară a unora dintre aceste efecte a fost publicată anterior (Norekian 1995). Influența excitativă puternică generală produsă de neuronul Cr-BM asupra tuturor rețelelor neuronale de hrănire identificate este probabil importantă în perioada de „extracție a prăzii” a comportamentului de hrănire după capturarea prăzii. În plus față de activarea generală, neuronul Cr-BM are o puternică influență de coordonare asupra elementelor individuale ale fiecărei rețele neuronale, ceea ce contribuie la coordonarea dependentă de fază a activității lor ritmice. Interneuronul Cr-BM utilizează aparent GABA ca emițător de excitare pe baza experimentelor cu dublă etichetare, imitând efectul GABA exogen și blocând efectele antagoniștilor GABA. Acesta reprezintă un alt exemplu interesant al rolului excitator al GABA în comportamentul alimentar al Clione (Arshavsky și colab. 1993; Norekian 1999).
Exemplare adulte de C. limacina au fost colectate la Friday Harbor Laboratories, Universitatea din Washington (Friday Harbor, WA) în sezonul de primăvară - vară și la Laboratorul maritim al Mării Albe al Institutului Zoologic (Marea Albă, Rusia) în sezonul de vară - toamnă. Animalele au fost ținute în borcane de 1 galon la frigider la 5-7 ° C. Înainte de disecție, animalele au fost anesteziate într-un amestec 1: 1 de apă de mare și MgCl2 izotonică și apoi fixate strâns pe o placă Petri acoperită cu elastomer de silicon (Sylgard). Au fost efectuate experimente electrofiziologice pe preparate reduse constând din SNC, cap și aripi. Toți nervii centrali care inervau capul erau intacti. Înainte de înregistrarea electrofiziologică, teaca ganglionilor centrali a fost înmuiată prin scăldarea preparatului într-o soluție de 1 mg/ml de protează (Sigma, tip XIV) timp de 5 minute, urmată de o spălare de 30 de minute în apă de mare filtrată.
Înregistrările intracelulare de la neuroni individuali au fost realizate cu microelectrozi de sticlă (rezistențe: 10-30 MΩ) umplute cu 2 M acetat de potasiu. Semnalele electrofiziologice au fost amplificate, afișate și înregistrate folosind tehnici electrofiziologice convenționale. Stimularea intracelulară a fost realizată printr-un circuit de punte amplificator. Pentru a testa conexiunile monosinaptice, a fost utilizată o soluție de cationi cu înaltă divalență [conținând (în mM) 110 MgCl2, 25 CaCl2, 400 NaCl, 10 KCl și 3 NaHCO3, pH 7,4]. Pentru investigarea morfologică a neuronilor înregistrați, o soluție de 5% de 5 (6) -carboxifluoresceină (Sigma) preparată în acetat de potasiu 2 M a fost iontoforizată prin intermediul electrozilor de înregistrare (rezistențe, 20-40 MΩ) cu curent negativ de 1 până la 10-nA impulsuri timp de 5-30 min. Celulele injectate au fost observate în direct în vasul de înregistrare cu un microscop de epifluorescență Nikon și cu un microscop confocal cu scanare laser MRC 600 BioRad (Hercules, CA).
GABA a fost aplicat local pe soma neuronilor identificați prin ejecție de presiune sau aplicare ionoforetică. Pentru ejectarea sub presiune, micropipetele de sticlă au fost umplute cu soluție de 5 mM GABA în apă de mare filtrată și conectate la sistemul de presiune a aerului (PV830 Pneumatic PicoPump, WPI), care a furnizat impulsuri de presiune de 40-60 p.s.i. și 200-ms durată. S-a adăugat colorant Fast Green (0,02%) în soluția de monitorizare a eliberării medicamentului. Pentru aplicații iontoporetice, am folosit micropipete de sticlă cu diametrul vârfului 1-2 μm umplute cu soluție 1 M GABA (pH 4). Curenții ionoforetici au avut amplitudine între 50 și 100 nA și au fost aplicați sub formă de impulsuri scurte cu durata de 50 - 100 ms (Stimulator S4KR și Unitatea de izolare Stimulus SIU 4678, Instrumentele de iarbă). Antagoniștii GABA au fost aplicați cu utilizarea unei pipete gradate de 1 ml. Concentrația finală a fost estimată din volumul cunoscut de soluție injectată și volumul cunoscut de soluție salină în vasul de înregistrare.
Pentru experimentele cu dublă etichetare, interneuronii au fost injectați cu neurobiotină (Vector Laboratories). Preparatele au fost apoi fixate în paraformaldehidă 4% și glutaraldehidă 0,1% în PBS și incubate 12 ore în avidină marcată cu roșu Texas (Vector Laboratories) pentru a vizualiza interneuronii plini de neurobiotină. Preparatele au fost apoi prelucrate pentru reacția imunocitochimică descrisă în textul precedent. Prin schimbarea filtrelor în microscopul de fluorescență sau microscopul confocal cu scanare laser pentru roșu Texas și fluoresceină, interneuronii au fost identificați ca imunoreactivi GABA. Texas Red nu a fost vizibil cu filtrele de fluoresceină, iar fluoresceina nu a fost vizibilă cu filtrele Texas Red, oferind astfel o comparație clară în timpul comutării filtrului.
Morfologia interneuronului Cr-BM și efectul general asupra rețelelor neuronale
Interneuronul Cr-BM simetric bilateral a fost localizat pe suprafața ventrală a ganglionilor cerebrali din regiunea anterioară dintre nervii capului N1 și N2 care inervează capul animalului (Fig. 1). Dimensiunea corpului celulei a fost de 25-30 μm în diametru. Un singur axon mare al neuronului Cr-BM a ieșit din ganglionii cerebrali în conjunctivul ipsilateral cerebro-bucal și a inervat neuropilul ambilor ganglioni bucali (Fig. 1). Câteva procese mici s-au ramificat și în neuropilul ganglionului cerebral ipsilateral. Structura morfologică a 16 interneuroni Cr-BM a fost studiată în 12 preparate după injecție intracelulară cu colorant fluorescent carboxifluoresceină.
FIG. 1.Structura morfologică a interneuronului Cr-BM drept injectat cu carboxifluoresceină. Corpul celulei este situat în ganglionii cerebrali (Cer) în apropierea bazei nervilor capului N1 și N2 și proiectează un axon mare către ganglionii bucali (Buc) prin intermediul conectivului cerebro-bucal (cbc). Microfotografia a fost obținută folosind microscopul cu epifluorescență.