Efectele acidului citric asupra stresului oxidativ al creierului și ficatului la șoarecii tratați cu lipopolizaharide
Omar M.E. Abdel-Salam
1 Departamentul de toxicologie și narcotice, Centrul Național de Cercetări, Cairo, Egipt
Eman R. Youness
2 Departamentul de Biochimie Medicală, Centrul Național de Cercetări, Cairo, Egipt
Nadia A. Mohammed
2 Departamentul de Biochimie Medicală, Centrul Național de Cercetări, Cairo, Egipt
Safaa M. Youssef Morsy
2 Departamentul de Biochimie Medicală, Centrul Național de Cercetări, Cairo, Egipt
Enayat A. Omara
3 Departamentul de patologie, Centrul Național de Cercetări, Cairo, Egipt
Amany A. Sleem
4 Departamentul de farmacologie, Centrul Național de Cercetări, Cairo, Egipt
Abstract
Introducere
Acidul citric (acidul 2-hidroxi-1,2,3-propan-tricarboxilic) este un acid organic slab găsit în cele mai mari cantități în citrice, cum ar fi lămâia, grapefruitul, mandarina și portocala. Sucurile de lămâie și lime sunt surse bogate. 9 Este folosit ca conservant natural și, de asemenea, pentru a adăuga un gust acid (acru) la alimente și băuturi răcoritoare. 10 Fiind o componentă a acidului tricarboxilic sau a ciclului Krebs, acidul citric se găsește în toate țesuturile animale ca substanță intermediară în metabolismul oxidativ. Studiile au indicat faptul că citratul scade peroxidarea lipidelor și reglează în jos inflamația prin reducerea degradării celulelor polimorfonucleare și atenuarea eliberării mieloperoxidazei, elastazei, interleukinei (IL) -1β și a factorului plachetar 4. 11-13 In vitro, citratul a îmbunătățit funcția endotelială prin reducerea inflamației inflamatorii. markeri și diapezeza neutrofilelor în scădere în hiperglicemie. 14 Mai mult, acidul citric s-a dovedit că reduce leziunile hepatocelulare evocate la șobolani de tetraclorura de carbon. 15 Acidul citric s-ar putea astfel dovedi valoros în scăderea stresului oxidativ.
Astfel, având în vedere efectele antioxidante și antiinflamatorii pentru citrat raportate chiar acum și deoarece anticoagularea citratului a fost utilizată la pacienții cu afecțiuni critice, s-a părut pertinent să se studieze efectul administrării acidului citric asupra stresului oxidativ și a leziunii țesuturilor într-un model a bolilor inflamatorii sistemice cauzate de administrarea intraperitoneală (ip) de lipopolizaharide (LPS) la șoareci. LPS este un component al pereților celulari ai bacteriilor gram-negative. Atunci când este administrat sistemic, LPS stimulează puternic celulele imune din periferie (prin intermediul proteinelor din membrana plasmatică, de exemplu, receptorul cu taxă 4 [TLR4] și CD14) pentru a elibera citokine proinflamatorii, cum ar fi factorul de necroză alfa (TNF-α), IL -1β și IL-6 în periferie și creier. Acest lucru are ca rezultat dezvoltarea sistemică și a neuroinflamării. 16-19 endotoxemie indusă de LPS este un model bine stabilit pentru infecția cu bacterii gram-negative și este utilizată pe scară largă pentru a studia efectele endotoxinei asupra țesutului/organelor periferice și a influenței inflamației sistemice asupra creierului.
Materiale și metode
Animale
Au fost folosiți șoareci albini masculi elvețieni care cântăresc 22-25 g (vârsta 5-6 săptămâni). Șoarecii au fost obținuți din colonia de animale a Centrului Național de Cercetare. Hrana și apa standard de laborator au fost furnizate ad libitum. Procedurile la animale au fost efectuate în conformitate cu Comitetul de etică al Centrului Național de Cercetare și au urmat recomandările Institutului Național de Sănătate Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (Publicația nr. 85-23, revizuită 1985).
Droguri și substanțe chimice
S-a utilizat o endotoxină Escherichia coli purificată, liofilizată (Serotipul 055: B5; Sigma); a fost dizolvat în ser fiziologic steril, alicotat și congelat la -20 ° C. Aceleași soluții stoc au fost utilizate pentru toate experimentele. Acidul citric și toate celelalte substanțe chimice au fost de calitate analitică și au fost obținute de la Sigma. Doza de LPS (200 μg/kg) și timpul de prelevare a țesuturilor s-au bazat pe studii anterioare. 20
Design de studiu
Șoarecii au fost împărțiți în mod aleatoriu în cinci grupuri egale (câte șase șoareci fiecare). Șoarecii au fost tratați fie cu 0,2 ml de: ser fiziologic steril (grupa 1) sau acid citric la doze de 1, 2 și 4 g/kg, pe cale orală (grupele 2-4). Tratamentele au fost administrate chiar înainte de administrarea endotoxinei (LPS: 200 lg/kg, injectat intraperitoneal, 0,1 ml). Al cincilea grup a primit doar vehiculul, fără LPS (control negativ). Șoarecii au fost eutanasiați după 4 ore de LPS sau injecția vehiculului prin decapitare sub anestezie cu eter, unde creierul și ficatul fiecărui șoarece au fost apoi îndepărtați, spălați cu soluție salină tamponată cu fosfat rece ca gheața (PBS; pH 7,4), cântărită și depozitată la −80 ° C până la analizele biochimice. Țesuturile au fost omogenizate cu 0,1 M PBS la pH 7,4, pentru a da o concentrație finală de 0,1 g/ml pentru testele biochimice. Activitatea redusă GSH, malondialdehidă (MDA), oxid nitric (nitrit), GPx și paraoxonază 1 (PON1) a fost determinată în țesuturile creierului și ficatului. TNF-a a fost măsurat în țesutul cerebral. Alanina aminotransferază (ALT), aspartat aminotransferază (AST) și fragmentarea ADN au fost măsurate în țesutul hepatic.
Determinarea peroxidării lipidelor, niveluri reduse de GSH și de nitriți
Peroxidarea lipidelor a fost testată prin măsurarea nivelului de MDA în țesutul cerebral folosind metoda Ruiz-Larrea și colab. 21 GSH redus a fost determinat în țesut prin metoda lui Ellman. 22 Oxidul de azot măsurat ca nitrit a fost determinat folosind reactivul Griess, conform metodei Moshage și colab. 23
Determinarea activității GPx
Activitatea GPx în supernatante a fost determinată spectrofotometric la 340 nm prin analiza oxidării NADPH utilizând trusa de glutation peroxidază (Biodiagnostic). 24 O unitate de activitate GPx este definită ca cantitatea de proteină care a oxidat 1 mM NADPH pe minut. Activitatea GPx este exprimată ca mU/ml.
Determinarea activității paraoxonazei
Activitatea arilesterazei paraoxonazei a fost măsurată spectrofotometric în supernatante folosind acetat de fenil ca substrat. 25,26 În acest test, arilesteraza/paraoxonaza catalizează scindarea acetatului de fenil, rezultând formarea fenolului. Rata de formare a fenolului a fost măsurată prin monitorizarea creșterii absorbanței la 270 nm la 25 ° C. Reactivul de lucru a constat din 20 mM tampon Tris/HCI (pH 8,0) conținând 1 mM clorură de calciu și 4 mM acetat de fenil ca substrat. Se adaugă probe diluate 1: 3 în tampon și modificarea absorbanței este înregistrată după un decalaj de 20 s. Absorbanta la 270 nm a fost luată la fiecare 15 s timp de 120 s folosind un spectrofotometru de înregistrare UV-Vis (Shimadzu Corporation). O unitate de activitate arilesterază este egală cu 1 μM de fenol format pe minut. Activitatea este exprimată în kU/L, pe baza coeficientului de stingere al fenolului de 1310 M/cm la 270 nm, pH 8,0 și 25 ° C. Probele goale care conțin apă sunt utilizate pentru a corecta hidroliza spontană a acetatului de fenil.
Determinarea TNF-α, a fragmentării ADN și a enzimelor hepatice
TNF-a de țesut a fost determinat în țesutul cerebral în conformitate cu Chen și colab. 27 prin test imunosorbent legat de enzime folosind kituri TNF-α (Biosource International) și cititor de plăci de microtitrare (Fisher Biotech). Cuantificarea fragmentării ADN-ului în țesutul hepatic a fost făcută în conformitate cu metoda descrisă de Gercel-Taylor. 28 de activități ALT și AST în ficat au fost măsurate folosind kituri disponibile comercial (BioMérieux). 29.30
Evaluarea histologică a leziunii hepatice
Ficatul de la fiecare șoarece a fost îndepărtat rapid și fixat în formalină tamponată proaspăt 10% neutră, procesat în mod curent și încorporat în parafină. Secțiuni de 5 μm grosime au fost tăiate și colorate de hematoxilină și eozină (H&E) pentru examen histopatologic. Toate secțiunile au fost investigate cu microscopul cu lumină.