Drosophila melanogaster ca model de screening pentru antinefrolitiaza bazat pe funcții

ABSTRACT

INTRODUCERE

Nefrolitiaza (pietre la rinichi) este o afecțiune urologică comună care afectează aproximativ 10% din populație în țările industrializate (López și Hoppe, 2010; Romero și colab., 2010). În Statele Unite, prevalența bolii de calculi a crescut de la 5,2% (1994) la 8,4% (2012) (Scales și colab., 2012). La nivel global, incidența și prevalența nefrolitiazei demonstrează o tendință similară și contribuie semnificativ la dezvoltarea bolii renale cronice (CKD) (El-Zoghby și colab., 2012; Romero și colab., 2010). Povara economică a nefrolitiazei este substanțială, cheltuielile anuale raportate la 5,3 miliarde de dolari doar în Statele Unite (Kovshilovskaya și colab., 2012). În ciuda costurilor și morbidității semnificative legate de nefrolitiază, cu rate de recurență pe 5 ani care se apropie de 50% la indivizii afectați, rămâne o înțelegere completă a nefrolitiazei la nivel molecular (Katsuma și colab., 2002; Lotan și colab., 2004). Patogeneza nefrolitiazei de oxalat de calciu, cel mai frecvent subtip de piatră (80%), este multifactorială (Finkielstein, 2006). Factorii predispozanți includ tulburări metabolice, cum ar fi hipercalcurie, hiperoxalurie sau hipocitraturie, și factori de mediu, cum ar fi dieta. Aceste elemente etiologice perturbă homeostazia biochimică metastabilă a urinei, culminând în final cu depunerea cristalelor și formarea de pietre (Pak, 1998).

screening

Strategiile de prevenire a tratamentului medical pentru nefrolitiaza oxalatului de calciu, care au rămas relativ stagnante de la mijlocul anilor 1980, variază în funcție de etiologia de bază. Dovezile actuale sugerează că citratul de potasiu și diureticele tiazidice sunt agenți eficienți în prevenirea formării de pietre de oxalat de calciu în stările de hipocitraturie și hipercalcurie (Qaseem și colab., 2014; Reilly și colab., 2010). În schimb, în ​​hiperoxalurie primară și idiopatică, surse proporționale importante de formare de piatră de oxalat de calciu, dovezile sunt rare pentru un tratament medical eficient. Piridoxina a fost sugerată în trecut pe baza mai multor studii clinice mici, aleatorii (Balcke și colab., 1983; Mitwalli și colab., 1988; Rattan și colab., 1994). Abordări mai noi, cum ar fi tratamentul cu probiotice și oxalat decarboxilază, au generat rezultate mixte (Moe și colab., 2011; Xu și colab., 2013).

Progresul a fost probabil limitat din cauza lipsei unor modele preclinice adecvate care să recapituleze fiziopatologia acestei tulburări. Mai multe modele animale au fost stabilite anterior pentru studiul nefrolitiazei, inclusiv modele de șobolani, șoareci, porcine și canine (Khan, 1997). Din punct de vedere istoric, cel mai proeminent dintre acestea a fost modelul de șobolan de nefrolitiază. Modelul de șobolan se bazează pe manipularea dietei sau injecția intraperitoneală a agenților litogeni (etilen glicol, clorură de amoniu sau vitamina D3) pentru a induce formarea calculului (Khan, 1997; Liu și colab., 2007). Utilizarea acestui model a generat rezultate variabile cu formarea inconsistentă a pietrei. În plus, nefrotoxicitatea agenților litogeni are o utilitate generală limitată (Khan și Glenton, 2010; Khan și colab., 2006).

Cu această descoperire, am dezvoltat noi tehnici de imagistică pentru vizualizarea și cuantificarea sarcinii de piatră de oxalat de calciu în modelul Drosophila de nefrolitiază a oxalatului de calciu. Acest lucru a condus la dezvoltarea unei platforme funcționale de screening cu randament ridicat, permițându-ne să examinăm bibliotecile chimice pentru a identifica compuși noi care prezintă activitate antilitogenă in vivo și sunt ingerabili. Deși acest model nu recapitulează pe deplin procesele de formare a calculilor la mamifere, am identificat cu succes compuși care au fost foarte eficienți în oprirea formării calculului. Hidrochinona β-D-glucopiranozidă, cunoscută în mod obișnuit sub numele de arbutină, este un glicozid cu porțiuni de hidroxichinonă (HQ), cel mai frecvent izolat din Arctostaphylos uva-ursi sau din arbustul pitic Bearberry (Pop și colab., 2009). S-a văzut că arbutina leagă atât ionii de calciu liberi, cât și oxalatul, servind ca antagonist dublu la cristalizarea oxalatului de calciu. Această descoperire a indicat faptul că alți compuși antilitogeni noi pot fi descoperiți într-o manieră similară, datorită dezvoltării în primul rând celulare a pietrelor la rinichi.

REZULTATE

Sondele bifosfonați se leagă de calculii oxalatului de calciu format din Drosophila

Formarea calculilor oxalatului de calciu la D. melanogaster. (A) Imagini confocale și birefringențe ale cristalelor pulverizate de oxalat de calciu uman (rândul superior) și particule sintetice de hidroxiapatită (rândul inferior) colorate cu sondă alendronat-FITC. Bare de scară: 1 mm. (B) Schema modelului D. melanogaster al formării calculilor de oxalat de calciu în tubulii malpighieni (MT). (C) Imagistica intravitală a semnalului de birrefringență reprezentând calculi pe bază de oxalat în MT de larvele D. melanogaster. Imagistica intravitală a larvelor D. melanogaster induse de dietă care exprimă dietă indusă de calciu-oxalat-piatră. Săgeata indică un RFP + MT cu semnal birefringent (C, jos). Bare de scară: 1 mm. (D) MT disecate relevă prezența depozitelor pozitive (săgeți) alendronat-FITC în cadrul RFP + MT, confirmând prezența calculilor pe bază de oxalat. Barele de scalare: 25 µm. (E) MT disecate așa cum sunt imaginate prin câmp luminos sau microscopie electronică cu scanare (SEM). Săgeata întreruptă reprezintă complexul tubular și intestinal al malpighianului. Săgeata solidă arată un calcul MT. (F) Analiza cu raze X SEM/dispersivă a energiei (EDX) a calculilor oxalat de calciu monohidrat extrasa din MT. Bara de scalare: 3 µm. (G) Analiza SEM/EDX a calculilor de deshidrat de oxalat de calciu extrasa din MT. Bara de scalare: 3 µm.