Domeniul omologiei liprinei este esențial pentru interacțiunea homomerică a proteinei SYD-2 Liprin-α în

Abstract

Introducere

Sinapsele chimice constau dintr-un terminal presinaptic, o fisură sinaptică și o specializare postsinaptică. Zona activă presinaptică, prin care sunt eliberați neurotransmițători, acumulează un set distinct de proteine ​​(Zhai și Bellen, 2004). În timpul diferențierii presinaptice, aceste proteine ​​sunt livrate printr-un transport pe bază de vezicule și sunt asamblate la locurile sinaptice născute pentru a forma o nanostructură organizată (Jin și Garner, 2008). Mecanismele moleculare ale modului în care este inițiată și reglată asamblarea componentelor presinaptice rămân necunoscute.

omologiei

Proteinele familiei Liprin-α sunt proteine ​​pentru schele (Spangler și Hoogenraad, 2007). Jumătățile N-terminale ale proteinelor sunt bogate în spirale și conțin două segmente extrem de conservate numite „regiunile de omologie Liprin-α 1 (LH1) și 2 (LH2)” (Schoch și colab., 2002). Jumătățile C-terminale conțin trei domenii conservate de steril-α-motiv (SAM), adesea denumite LHD (pentru domeniul omologiei liprinului), care leagă proteina receptor de tip LAR tirozin fosfatază (Serra-Pagès și colab., 1998). N-terminalul Liprin-α poate lega mai multe proteine, inclusiv RIM (Schoch și colab., 2002) și ELKS/ERC/CAST (Ko și colab., 2003), care joacă roluri distincte în eliberarea veziculelor presinaptice. Funcțiile in vivo ale Liprin-α în sinapse au fost cel mai bine studiate la nevertebrate. Caenorhabditis elegans SYD-2 și Drosophila Liprin-α sunt localizate în centrul zonelor active presinaptice și sunt necesare pentru organizarea zonei active în diferite tipuri de neuroni (Zhen și Jin, 1999; Kaufmann și colab., 2002; Yeh și colab., 2005; Fouquet și colab., 2009; Stigloher și colab., 2011).

În neuronii motori specifici hermafroditului C. elegans (HSN), SYD-2/Liprin-α și o proteină RhoGAP SYD-1 sunt esențiale pentru asamblarea componentelor presinaptice din aval. Activitatea SYD-2 depinde în parte de ELKS-1 și de un nou regulator negativ RSY-1 (Dai și colab., 2006; Patel și colab., 2006; Patel și Shen, 2009). Am raportat anterior că o mutație missense, syd-2 (ju487gf), modifică Arg184 la Cys în domeniul LH1 și provoacă un efect de câștig de funcție, astfel încât proteina mutantă să poată promova asamblarea componentelor sinaptice chiar și în absența SYD-1 (Dai și colab., 2006). Supraexprimarea SYD-2 poate, de asemenea, să ocolească cerința SYD-1 (Dai și colab., 2006; Patel și colab., 2006). Aceste observații arată că activitatea SYD-2 este critică pentru asamblarea presinaptică adecvată. Au fost raportate anterior interacțiuni homomerice ale SYD-2/Liprin-α (Serra-Pagès și colab., 1998; Wagner și colab., 2009; Astigarraga și colab., 2010). Cu toate acestea, rămâne puțin înțeles dacă interacțiunea homomeră este importantă pentru funcția lor și modul în care este mediată.

Aici, am efectuat studii transgenice și biochimice pentru a aborda rolul domeniului conservat LH1 al SYD-2. Datele noastre susțin o propunere care auto-asamblează proprietatea SYD-2/Liprin-α mediată de dimerizarea domeniului LH1 promovează o ordine mai mare de oligomerizare și grupare, care este esențială pentru formarea presinaptică.

Materiale și metode

Construcția plasmidei.

Plasmidele de expresie au fost generate urmând metode standard sau folosind sistemul de clonare Gateway (Invitrogen). Promotorii Prgef-1 și Punc-86 au fost utilizați pentru expresiile pan-neuronale și respectiv HSN. Construcțiile SYD-2 mutante sau Liprin-α1A umane au fost realizate prin PCR utilizând ADNc-uri ca șabloane (Serra-Pagès și colab., 1998; Zhen și Jin, 1999) și verificate prin secvențiere. Oligo nucleotidele pentru peptida GCN-IL (RMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGER) cu distanțiere (GGSGG) au fost utilizate pentru a genera SYD-2-DI. ADNc GIT-1 (Source BioScience) a fost donat în pPD49.26 cu YFP ca o etichetă C-terminal condusă de promotorul Punc-86. Informații detaliate pentru plasmide sunt disponibile la cerere.