Diferențe în expresie, conținut și activitate a 11β-HSD1 în țesutul adipos între bărbații obezi
A. Torres
1 Institutul de cercetare maternă și infantilă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Chile, Casilla 226-3, 8360160 Santiago, Chile
Domnule Iñiguez
1 Institutul de cercetare maternă și infantilă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Chile, Casilla 226-3, 8360160 Santiago, Chile
M. Ferrario
2 Departamentul de Chirurgie, Clínica Las Condes, Santiago, Chile
V. Mericq
1 Institutul de cercetare maternă și infantilă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Chile, Casilla 226-3, 8360160 Santiago, Chile
Abstract
La toți subiecții, înainte de intervenția chirurgicală, a fost prelevată o probă de sânge în repaus alimentar. Informațiile antropometrice (vârsta, greutatea și înălțimea) au fost obținute din datele clinice ale fiecărui subiect.
În timpul procedurii, s-au obținut 5 g de țesut adipos visceral (TVA) și 5 g de țesut adipos subcutanat (SAT). Probele au fost obținute de la Centrul de Chirurgie a Obezității din Clínica Las Condes și Spitalul Clinic San Borja-Arriarán din Santiago, Chile. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Revizuire Instituțională din Clínica Las Condes și toți pacienții au dat consimțământul scris în scris la recrutare.
2.1. Prelucrarea țesutului adipos
În timpul intervenției chirurgicale a fost obținut un eșantion de țesut adipos din compartimentele subcutanate și viscerale. Ambele probe au fost curățate, împărțite imediat și congelate în azot lichid și menținute la –80 ° C pentru extracția totală a ARN-ului și analiza proteinelor.
2.2. Analize biochimice serice
Insulina serică a fost determinată de IRMA (DIAsource, Belgia), cu un coeficient de variație intra și interanaliză (CV) de 2,1 și respectiv 4,5%. Glucoza a fost măsurată prin metoda glucozei oxidazei de la Roche Diagnostics (Mannheim, Germania), cu un CV intra-test și inter-test de 2,5%. Colesterolul total seric, trigliceridele și colesterolul HDL și LDL au fost cuantificate prin sistemul de diagnostic Reflotron (Roche Diagnostics). Trigliceridele au fost măsurate enzimatic folosind o metodă spectrofotometrică. CV-urile intra și interanalize au fost de 1,9 și respectiv 3,7%. Sensibilitatea la insulină (IS) a fost estimată din insulina de post (I0) și nivelurile de glucoză utilizând modelul homeostaziei (HOMA-IR) [13].
2.3. Testele de expresie
2.3.1. Izolarea și cuantificarea ARN-ului total
ARN-ul total a fost extras din aproximativ 100 mg de TVA și SAT folosind reactiv TRIzol (Invitrogen Corp., CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Bucățile de țesut adipos au fost omogenizate în 1 ml de TRIzol suplimentat cu glicogen (0,25 mg/ml, Amersham Life Sciences) folosind un omogenizator mecanic (Kontes Glass Company, Vineland, NJ, SUA) fazele au fost separate prin centrifugare (12000 rpm timp de 20 min la 4 ° C) după adăugarea de cloroform. Pentru precipitarea ARN, izopropanolul a fost adăugat la supernatant și centrifugat la 12000 rpm cu 15 minute la 4 ° C. Peleta a fost spălată în 500 pl etanol 75%. ARN a fost resuspendat în apă tratată cu dietilpirocarbonat. Integritatea ARN a fost evaluată prin electroforeză pe geluri de agaroză 2% (greutate/volum), iar cantitatea a fost determinată spectrofotometric într-un NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, SUA). ADN-ul complementar a fost sintetizat din 2 μg de ARN total digerat anterior de DNAse I (Fermentas, SUA) folosind primerii aleatori (Invitrogen) și 200 U revers transcriptază RevertAid H Minus M-MuLV (Fermentas), urmând instrucțiunile producătorului.
2 μL ADNc a fost utilizat pentru amplificarea 11β-HSD1 ajustat la un volum total de 25 μL prin adăugarea de tampon PCR conținând 3 mmol/LMgCl2, 0,63 U Taq ADN polimerază (Invitrogen), un amestec de nucleotide și 0,4 μmol/L din fiecare din două grunduri specifice (în amonte: 5 ′ ′ - AGGAAAGCTCATGGGAGGACTAG-3 ′ ′ și în aval: 5 ′ ′ - ATGGTGAATATCATCATGAAAAAGATTC-3 ′ ′). Reacția a fost efectuată în Thermocycler PT-100 (MJ Research Inc., Watertown, MA, SUA) folosind condiții care au fost anterior standardizate: denaturarea la 94 ° C timp de 1 min; recoacere la 55 ° C timp de 1 min; extindere la 72 ° C timp de 1 min 30 seg și repetarea acestora timp de 31 de cicluri.
Ca control intern, ADNc 18S rARN a fost amplificat în fiecare probă în aceleași condiții descrise mai sus, cu excepția 1,5 mmol/L MgCl2 și repetat timp de 18 cicluri. Pentru a determina că amplificarea tuturor genelor se încadra într-un interval liniar, am evaluat liniaritatea amplificării transcrierilor corespunzătoare în țesutul adipos și ulterior am selectat numărul de cicluri. Ampliconii de (139 pb, pentru 11β-HSD1 și 191 pb pentru 18S rARN) au fost vizualizați pe gel de agaroză 2% folosind GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium). Semi-cuantificarea produselor PCR a fost realizată prin analiza imaginii (KODAK EDAS 290 Sistem de documentare și analiză a electroforezei, software Kodak 1D Image Analysis). Rezultatele sunt exprimate ca raportul dintre gena studiată de ARNm/ARNr 18S (AU = unități arbitrare).
2.4. Analize enzimatice
Extragerea proteinelor -
Țesuturile TVA și SAT au fost omogenizate în PBS 0,1 M răcit cu gheață pH 7,5 suplimentat cu antiproteaze (tablete complete, mini, fără EDTA, inhibitoare de protează, cocktail-uri, Roche Applied Science). Omogenatul tisular a fost apoi centrifugat la 12000 rpm timp de 30 min la 4 ° C și supernatantul rezultat a fost colectat și testat pentru concentrația de proteine folosind kitul de testare a proteinei BCA (Pierce, Rockford, IL, SUA) cu BSA ca standard.
2.4.1. Activitatea enzimatică a 11β-HSD1
Testul enzimatic a fost descris anterior de Mericq și colab. [14], modificat pentru a se potrivi tipului de țesut în studiu. Condițiile de reacție au fost stabilite folosind diferite concentrații de cofactor, cortizon neetichetat și timpul de incubație. De asemenea, a fost evaluată linearitatea reacției enzimatice.
Pe scurt, 200 μg de extract proteic au fost incubate în 0,5 ml tampon fosfat (0,1 mol/L pH 7,6) în prezența a 25000 c.p.m. de [3] -cortizon (Amersham, Marea Britanie), 0,05 μM cortizon și 400 μM NADPH (Sigma Chemicals). Reacția a fost inițiată cu adăugarea cofactorului timp de 24 de ore la 37 ° C într-o baie de apă agitată. Alicote au fost extrase în 7 volume de diclormetan și steroizii au fost separați prin cromatografie în strat subțire de înaltă performanță (HPTLC, Merck), folosind metanol-cloroform (8: 92) ca fază mobilă. Benzile care conțin cortizonul și cortizolul marcate au fost identificate prin lumina UV a purtătorilor reci, tăiate și numărate într-un contor de scintilație (Tracor Analytic Delta 300). Ratele de cortizon la cortizon au fost calculate din activitatea specifică a cortizolului marcat și radioactivitatea cortizolului (picograme) formate pe mg de proteină pe oră.
2.4.2. Analiza Western Blot
Cantități egale (12,5 μg) de proteine adipoase au fost rezolvate prin electroforeză utilizând geluri SDS-poliacrilamidă 14% și apoi transferate în membrane de nitroceluloză (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA). Membranele au fost blocate cu 5% BSA în TBS-T (20 mmol/L Tris pH 7,2, 137 mmol/L NaCI, 0,1% (v/v) Tween-20) timp de 1 oră la temperatura camerei. Bloturile au fost testate cu anticorpi împotriva 11β-HSD1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA) și a β-actinei (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). După o spălare extinsă, benzile au fost detectate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean (Rockland Immunochemical Research, Gilbertsville, PA, SUA), urmată de chemiluminescență îmbunătățită (ECL plus Western Blotting Detection System; Amersham Biosciences, Little Chalfont, Marea Britanie). Imaginile au fost achiziționate și evaluate utilizând software-ul UltraQuant pentru achiziționarea și analiza imaginilor (Ultralum Inc., Claremont, CA, SUA), normalizate în raport cu β-actina și exprimate ca unități arbitrare (AU).