Dieta cu restricție de proteine ​​în timpul sarcinii după inseminare modifică fenotipurile comportamentale ale

Abstract

fundal

Studiile epidemiologice sugerează că hiponutriția în timpul perioadei fetale crește riscul de tulburări mentale, cum ar fi tulburarea de hiperactivitate cu deficit de atenție și tulburarea spectrului autist, care a fost susținută experimental folosind modele animale. Cu toate acestea, hiponutriția experimentală anterioară sau dietele cu restricție de proteine ​​(PR) au afectat alte stadii decât stadiul fetal, cum ar fi formarea oului înainte de inseminare, compoziția laptelui în timpul alăptării și comportamentul matern alăptării.

Rezultate

Am efectuat fertilizarea in vitro și transferul de embrioni la șoareci și am permis ca dieta PR și dieta PR suplimentată cu acid folic să afecteze numai mediile fetale. Fenotiparea cuprinzătoare a descendenților PR și a dietelor de control a arătat diferențe moderate în comportamentele asemănătoare fricii/anxietății, în căutarea de noutate și prosociale, indiferent de suplimentarea cu acid folic. Modificări au fost, de asemenea, detectate în expresia genelor și metilarea genomică în creier.

Concluzii

Aceste rezultate sugerează că factorii epigenetici din embrion/făt influențează fenotipurile comportamentale și epigenetice ale descendenților. Modificări epigenetice semnificative la nivelul creierului progeniturilor induse de restricția proteinei materne au fost observate în prezentul studiu. Din câte știm, acesta este primul studiu care evaluează efectul hiponutriției materne asupra fenotipurilor comportamentale folosind tehnologia reproductivă.

fundal

Cu toate acestea, dieta PR maternă afectează nu numai mediul fetal, ci și formarea oului înainte de inseminare, starea nutrițională a laptelui matern și comportamentul de alăptare maternă și, prin urmare, are potențiale variabile de confuzie în diferite stadii. În studiul de față, am efectuat fertilizarea in vitro (FIV) pentru a produce nou-născuți și apoi am obținut progenituri care au fost adoptate de mamele adoptive înainte de înțărcare. Acest lucru a permis ca dieta PR să afecteze doar stadiul de dezvoltare fetală.

Metode

Declarație etică a experimentelor pe animale

Toate procedurile descrise aici au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din filiala RIKEN Tsukuba și au fost efectuate în conformitate cu principiile directoare RIKEN pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (nr. 10-013).

Proiectare experimentală

după

Strategia experimentală. Proiectul experimental al acestui studiu este descris pe scurt. Dieta normală (CE-2) a fost hrănită la femelele folosite pentru colectarea ovocitelor și la bărbații folosiți pentru colectarea spermei. Mamele primitoare au consumat dieta de control (CD) sau dieta experimentală (PR și FA) timp de 1 lună înainte de transferul embrionului. Embrionii au fost generați prin fertilizarea ouălor cu spermă de șoareci C57BL/6J (B6). După nașterea prin cezariană, nou-născuții au fost încurajați de femele ICR care au consumat diete CD, PR sau FA. După înțărcare, descendenții au consumat dieta de control (CD). Serul a fost separat de sângele prelevat de la femelele ICR. Țesutul cerebral a fost colectat de la descendenți după testele de comportament

Dietele experimentale

CD-ul a fost foarte asemănător cu formarea standard a AIN93G [15]. Dietele testate au fost modificate din formularea AIN93G după cum urmează: PR, raportul cazeinei fără vitamine a scăzut de la 20 la 5%; FA, s-au adăugat 0,8 g/kg de acid folic la PR (Tabelul 1). CD și PR conțineau 0,02% acid folic (compoziție în greutate) și FA conținea 0,1% acid folic (compoziție în greutate). Dietele experimentale au fost achiziționate de la un furnizor comercial (Oriental drojdie Co. Ltd, Tokyo, Japonia). Aceste diete au fost izocalorice (4 kcal/g în fiecare furaj) și au fost hrănite mamelor destinatarilor ad libitum. În plus, doar dieta CD a fost hrănită mamelor adoptive ad libitum.

Toți șoarecii utilizați ca mamă primitoare și adoptivi, precum și pentru colectarea ovulelor și spermei, au fost cumpărați de la un furnizor comercial (CLEA Japan, Inc.).

Fecundarea in vitro și transferul embrionilor

Test clinic-biochimic

Am efectuat un test clinic-biochimic folosind ser colectat de la femele ICR la vârsta de 13 săptămâni. Șoarecii au consumat diete experimentale timp de 7 săptămâni. Recoltarea sângelui, separarea serului și analiza au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [20]. Pe scurt, am colectat 200 μl de sânge din sinusul retro-orbital folosind o pipetă Pasteur (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Sângele colectat a fost transferat într-un microtub care conține soluție de coagulant Wako (Wako Pure Chemical Industries Co, Osaka, Japonia) și serul a fost separat prin centrifugare de două ori (600-2500 ×g timp de 5–15 min). Am măsurat proteinele totale (TP), azotul ureei (UN), albumina (ALB), colesterolul total (T-CHO), HDL-colesterolul (HDL-C), trigliceridele (TG) și LDL-colesterolul (LD-C) în ser cu un analizor clinic-biochimic automat (JCA-BM2250, JEOL, Ltd., Tokyo, Japonia). Numărul de subiecte: CD, 7; PR, 7; FA, 6.

Extracția ADN/ARN

Am recoltat creiere întregi din descendenți masculi adulți (vârsta de 19 săptămâni) care au fost folosiți în analize comportamentale, analize de metilare și matrice de expresie. Bărbații adulți au fost eutanasiați prin luxația cervicală. Probele de creier au fost clătite cu PBS și congelate imediat folosind azot lichid. Țesuturile înghețate au fost depozitate la -80 ° C. ARN și ADN au fost extrase simultan folosind un mini kit AllPrep ADN/ARN (Qiagen, Valencia, CA, SUA) din întregul creier, inclusiv cerebrul și cerebelul. Am efectuat apoi metilarea genelor și matrici de expresie așa cum este descris mai jos.