Dieta bogată în grăsimi induce hipersensibilitatea căilor respiratorii la șoareci Rapoarte științifice
Subiecte
Abstract
Experimentul a fost realizat pentru a examina efectul unei diete bogate în grăsimi (HFD) asupra hiperreagonității căilor respiratorii (AHR) la șoareci. Douăzeci și trei de șoareci adulți C57BL/6 J de sex masculin au fost hrăniți cu HFD sau dietă regulată de chow timp de două săptămâni. Rezistența respiratorie totală a fost măsurată prin tehnica de oscilație forțată la momentul inițial și după provocarea aerosolului cu metacolină la 1, 3, 10 și 30 mg/ml. S-a efectuat spălarea bronhoalveolară (BAL). Nivelurile lipidice și peroxidarea lipidelor în țesutul pulmonar au fost măsurate împreună cu expresia genică a citokinelor multiple. Plămânii au fost digerați și s-a determinat secreția de IL-1β prin macrofage pulmonare. Hrănirea cu HFD a dus la o greutate corporală cu 11% mai mare comparativ cu chow. HFD nu a afectat rezistența respiratorie la momentul inițial, dar a crescut semnificativ răspunsurile căilor respiratorii la metacolină comparativ cu dieta chow (creștere cu 40,5 ± 17,7% la 30 mg/ml metacolină, p
Introducere
Astmul este una dintre cele mai frecvente boli și prevalența astmului continuă să crească, care a fost atribuită epidemiilor de obezitate 1,2,3. Astmul în obezitate pare să fie diferit de astmul alergic tipic condus de TH2, demonstrând un răspuns slab la corticosteroizii inhalați 4. Mecanismele posibile includ respirația la volume pulmonare mai mici, modificarea structurii căilor respiratorii, stresul oxidativ crescut al căilor respiratorii și o inflamație sistemică mai mare 5. Reglarea în sus a inflammasomului NLRP3 și a IL-1β a fost implicată în astmul în obezitatea indusă de dieta bogată în grăsimi (HFD) 6. HFD este proinflamator datorită efectelor directe ale acizilor grași liberi 7. Cu toate acestea, efectul unei diete bogate în grăsimi în sine asupra hiperreactivității căilor respiratorii (AHR) nu a fost investigat. Ipotezăm că dieta bogată în grăsimi induce inflamații care pot afecta AHR independent de obezitate.
Metode
Animale experimentale
Douăzeci și trei de șoareci adulți C57BL/6 J de vârstă de 10 săptămâni (Laboratorul Jackson, Bar Harbor, MA) au fost hrăniți cu HFD (TD 03584, Teklad WI, 5,4 kcal/g, 35,2% grăsime, 58,4% kcal din grăsime, n = 10) sau dieta chow (3,0 kcal/g, 4,4% grăsimi, 13% kcal din grăsimi, n = 13) timp de 14 zile. Detalii despre compoziția HFD sunt furnizate în tabelul suplimentar 1. HFD a fost refrigerat la 4-8 ° C înainte de a fi adăugat în cuști. A fost asigurată hrană și apă ad libitum. Șoarecii au fost adăpostiți într-un mediu de laborator standard la 22 ° C în ciclul de lumină/întuneric de 12 ore (luminile 9:00 - 21:00 aprinse/21:00 - 9:00 luminile stinse). Pentru a asigura reproductibilitatea măsurătorilor, șoarecii au fost separați în două loturi (lot 1, HFD, n = 5, dieta chow, n = 6; lot 2, HFD, n = 5, dieta chow, n = 7), care au fost studiate la șase luni distanță folosind diferite loturi de HFD. Studiul a fost aprobat de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea Johns Hopkins (Protocolul # MO15M257) și a respectat Ghidul Societății Fiziologice Americane pentru Studii pe Animale.
Măsurători fiziologice și histologie
În ziua 14, șoarecii au fost anesteziați cu ketamină/xilazină ip, traheostomizați și rezistența respiratorie totală (Rrs) a fost măsurată prin tehnica de oscilație forțată (Flexivent) la momentul inițial și după provocarea aerosolului cu metacolină la 1, 3, 10 și 30 mg/ml așa cum este descris 8.9. Sângele a fost colectat din aorta, spălarea bronhoalveolară (BAL) a fost efectuată cu 2 × 0,8 ml de soluție salină sterilă tamponată cu fosfat (PBS) printr-o canulă traheală. Toracele a fost deschis, iar plămânul drept a fost legat, disecat liber și înghețat imediat în azot lichid și depozitat la -80 ° C. Plămânul stâng rămas a fost umflat cu formalină la presiune de 26 cmH2O timp de 20 de minute, legat și plasat umflat în formalină timp de 2 zile. Volumul plămânului stâng a fost măsurat prin înlocuirea apei.
Pentru histologie, plămânul stâng a fost deshidratat în etanol și încorporat în parafină. Pentru morfometrie, secțiuni groase de 5 μm au fost tăiate din blocuri transversale și colorate cu tricrom Masson.
Analiza sângelui, a plasmei și a țesutului pulmonar
S-au determinat hemogramele complete (CBC). Trigliceridele și acizii grași liberi (FFA) au fost măsurați în omogenate pulmonare și plasmă cu truse de la Wako Inc (Richmond, VA). Insulina plasmatică și leptina au fost măsurate cu kituri de la Alpco Diagnostics (Salem, NH) și, respectiv, Abcam (Cambridge, MA). Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate cu un glucometru (ACCU-CHECK Aviva Plus, Roche, Indianapolis, IN). ARN-ul total a fost extras din țesutul pulmonar cu un reactiv Trizol (Life Technologies, Rockville, MD). ADNc a fost produs din ARN total utilizând kitul Advantage RT pentru PCR de la Clontech (Palo Alto, CA). S-a efectuat PCR în timp real pentru panoul de citokine, inclusiv interleukinele (IL) 1β, 4, 5, 6, 10, 13, 17, TNF-α, IL-21, IL-23, adiponectină, leptină, proteina P3 a cutiei capului furcii (FOXP3), metalopeptidaza matricială (MMP 9), precum și receptorii asemănători (TLR) −2 și 4 cu grunduri premade de la Invitrogen (Carlsbad, CA) și sondele Taqman de la Applied Biosystems (Foster City, CA) folosind 18 S ca genă de menaj (Tabelul suplimentar 2).
Grundurile personalizate de 18 S au fost 5'-CTCTTTCGAGGCCCTGTAATTGT-3 ', invers, 5'-AACTGCAGCAACTTTAATATACGCTATT-3' și sonda 6FAM-AGTCCACTTTAAATCCTT. Nivelul de ARNm țintă a fost normalizat la 18 s ARNr, utilizând formula: Țintă/18 s = 2 Ct (18s) –Ct (țintă). Activitatea factorului nuclear κB (NF- κB) a fost derivată din proteina IκBα fosforilată la totală cu un kit de la Abcam. Peroxidarea lipidelor în plămâni a fost măsurată în funcție de nivelul de malondialdehidă cu un kit de la Abcam.
Secreție de citokine și citometrie în flux
Disponibilitatea datelor
Toate datele generate sau analizate în timpul acestui studiu sunt incluse în acest articol publicat.
analize statistice
Toate valorile sunt raportate ca medii ± SEM. Toate datele din studiu au fost verificate pentru normalitate cu un test de bunătate de potrivire chi pătrat. Comparațiile statistice ale valorilor distribuite în mod normal au fost efectuate prin testul U Mann-Whitney. Semnificația statistică pentru valorile distribuite în mod normal a fost determinată de testul t al studentului sau de analiza bidirecțională a testului varianței (ANOVA) cu corecția Bonferroni, atunci când este cazul. O valoare p de
Rezultate
Caracteristicile inițiale ale animalelor experimentale sunt descrise în Tabelul 1. HFD hrănirea timp de 2 săptămâni a dus la o greutate corporală cu 11% mai mare decât la șoarecii hrăniți cu chow dublând dimensiunea tampoanelor de grăsime epididimale și retroperitoneale. De remarcat, tampoanele de grăsime inghinale nu au fost crescute. Hrănirea cu HFD a indus hiperglicemie și creșteri ale nivelului de insulină și leptină în plasmă, în timp ce trigliceridele plasmatice au fost neschimbate (Tabelul 1). Nu a existat nicio diferență în CBC (Tabelul suplimentar 3). Dieta nu a afectat volumul plămânului stâng, care a fost de 0,16 ml ± 0,03 pe o dietă chow și 0,18 ± 0,03 pe HFD.
Testarea funcției pulmonare nu a evidențiat nicio diferență în rezistența pulmonară totală la momentul inițial între șoarecii hrăniți cu chow și HFD (Rrs de 0,69 ± 0,04 cm H2O * s/ml și respectiv 0,63 ± 0,03 cm H2O * s/ml). HFD a crescut semnificativ răspunsurile căilor respiratorii la metacolină în comparație cu dieta chow (Fig. 1).
Dieta bogată în grăsimi (HFD) a crescut rezistența totală a sistemului respirator (Rrs) ca răspuns la metacolină. Valorile Rrs au fost normalizate până la momentul inițial (fără diferențe semnificative între grupuri la momentul inițial).
Efectul dietei bogate în grăsimi (HFD) care se hrănește asupra populației de leucocite din plămânii de șoarece. Limfocitele CD4, CD8, macrofagele interstițiale, monocitele și macrofagele alveolare au fost identificate prin citometrie în flux conform protocolului descris de Misharin și colab. (ref. 10) în (A) suspensie totală de leucocite pulmonare și (B) populația de celule aderente așa cum este descris în metode.