Descoperirea proteinelor serice biomarker în preeclampsie severă prin analiză proteomică
Abstract
Preeclapsia (EP) este o tulburare severă care apare în timpul sarcinii, ducând la morbiditate și mortalitate maternă și fetală. EP afectează aproximativ 3-8% din toate sarcinile. În acest studiu, am efectuat cromatografie lichidă spectrometrie de masă/spectrometrie de masă (LC-MS/MS) pentru a analiza probele de ser epuizate din cele șase proteine cele mai abundente din sarcinile normale și afectate de PE pentru a profila proteinele serice. Un total de 237 de proteine au fost identificate cu încredere cu
Introducere
Preeclampsia (PE) este o tulburare definită de hipertensiune cu debut nou și proteinurie după 20 de săptămâni de gestație care poate fi prezentă până la 4-6 săptămâni după naștere. EP afectează 3-8% din toate sarcinile și este o cauză majoră a morbidității și mortalității materne (Noris și colab., 2005). Cu toate acestea, patogeneza subiacentă a preeclampsiei rămâne necunoscută, iar dezvoltarea biomarkerilor adecvați pentru diagnosticul și prognosticul acesteia nu au fost încă dezvoltate (Jauniaux et al., 2006). PE se caracterizează, în general, după cum urmează: 1) în perioada timpurie a sarcinii, placenta eliberează mai mulți factori de creștere în circulația maternă, producând inflamații sistemice excesive ca răspuns la hipoxia ischemică și la stresul oxidativ (Borzychowski și colab., 2006). 2), disfuncția endotelială generalizată duce la simptome caracteristice materne ale preeclampsiei, cum ar fi hipertensiunea și proteinuria în perioada târzie a sarcinii (Taylor, 1997). Deși PE a fost studiat de multă vreme, în prezent nu există biomarkeri fiabili care să prevadă PE în timpul sarcinii timpurii.
Recent, multor grupuri li s-a acordat o atenție specială proteinelor serice legate de obezitate, inflamații de nivel scăzut și hipertriacilglicerolemie, care sunt simptome frecvente în PE (Smets și colab., 2006). Se consideră că diverse proteine serice contribuie la simptomele PE, cum ar fi factorul de creștere placentară (PlGF), factorul de creștere endotelial vascular (VEGF), factorul de creștere endotelial vascular solubil receptor-1 (sVEGFR-1), tirozin kinaza solubilă de tip fms -1 (sFlt-1), proteina placentară 13 (PP-13), proteina plasmatică asociată sarcinii (PAPP-A), gonadotrofina corionică umană (HCG), endoglinul solubil (sEng), alfa fetoproteina (AFP), insulină factorul de creștere-1 și proteina de legare a IGF-1 (IGFBP-1) (Muller și colab., 1996; Bersinger și Odegard, 2004; Audibert și colab., 2005; Venkatesha și colab., 2006; Baumann și colab., 2007 Spencer și colab., 2008; Teixeira și colab., 2008).
Diverse studii au arătat că nivelurile de expresie ale acestor proteine cresc sau scad în funcție de tulburare și gradul acesteia în PE (Baumann și colab., 2007). Cu toate acestea, nu este sigur dacă aceste proteine ar servi ca noi proteine marker pentru diagnosticul PE în practica clinică. Datorită acestor proteine specificități relativ scăzute pentru boală, este necesară o dezvoltare ulterioară pentru aplicarea sa de utilizare clinică.
Pentru a permite utilizarea comercială, este necesar să depășim provocări precum validarea, reproductibilitatea și specificitatea față de proteinele marker noi. În plus, analiza fluidului biologic care are o complexitate ridicată și o gamă dinamică necesită pregătiri elaborate înainte și tehnici mai sensibile (Hu și colab., 2006).
Din aceste motive, în acest studiu, am comparat sistematic proteomul seric matern la femeile cu PE și sarcina normală utilizând tehnologii proteomice bazate pe LC-MS după epuizarea proteinelor serice foarte abundente, cum ar fi albumina, imunoglobulina și transferul etc. Un total de 237 proteine serice au fost identificate cu încredere din probele de ser ale femeilor cu PE și normale de la 1% căutări ale ratei de detectare falsă (FDR). Dintre acestea, 97 de proteine având multiple peptide unice au fost reținute pentru compararea grupului. Nivelurile de expresie diferențiale ale proteinelor selectate au fost validate folosind o metodă spectrometrică de masă cantitativă, monitorizarea reacției selective (SRM) (Ji și colab., 2003) și testul imunitar legat de enzime (ELISA).
Rezultate
Exploatarea de noi biomarkeri din fluide biologice umane pune multe provocări care trebuie depășite printr-o abordare proteomică, cum ar fi gama dinamică largă în abundență și complexitate a componentelor proteinelor. În consecință, s-au făcut diverse încercări de a descoperi noi proteine biomarkere cu valori clinice (Whiteaker și colab., 2007). Aici ne-am străduit să identificăm noi proteine marker pentru PE utilizând LC-MS/MS dependent de date atât pentru identificare cât și pentru semicuantificare. Nivelul de expresie al proteinelor exprimate diferențial a fost validat în continuare prin metoda de cuantificare spectrometrică de masă, SRM și ELISA.
Am analizat probe individuale de ser de la cinci pacienți per grup în duplicat prin LC-MS/MS pentru a identifica proteinele serice (Tabelul 1). În această analiză, probele de ser colectate au fost tratate folosind o coloană de îndepărtare a afinității multiple (MARS) care conține șase anticorpi împotriva albuminei, IgG, IgA, transferină, haptoglobină și alfa-1-antitripsină (Ryu și colab., 2010). După epuizarea abundentă a proteinelor, probele de ser au fost digerate folosind o tripsină de grad de secvență pentru analiza LC-MS/MS pentru a compara proteomii serici de la femeile cu PE și cei de la femeile care suferă o sarcină normală.
Spectrele MS/MS rezultate au fost căutate cu algoritmi SEQUEST folosind o strategie de bază de date de compoziție țintă pentru a evalua încrederea peptidei (Ballif și colab., 2005). Am achiziționat 5984 și 5744 de spectre MS/MS din grupul PE (n = 5) și respectiv din grupul normal (n = 5). Un total de 237 proteine cu 1% FDR au fost atribuite din acele spectre (Figura 1A). Am limitat setul de proteine pozitive la proteine identificate de mai multe peptide. Dintre acestea, 97 de proteine au fost potrivite cu 2 ≤ peptide unice (Figura 1B) (Tabelul 2), iar acestea au fost supuse adnotării și validării ulterioare. În consecință, am identificat 85 de proteine și 90 de proteine care formează probe de ser de PE și, respectiv, probe de ser de sarcini normale. Dintre cele 85 de proteine identificate în grupurile PE, au fost identificate 49 de proteine la toți cei cinci pacienți. Mai mult, 49 de proteine au fost identificate la toți cei cinci pacienți dintre cele 90 de proteine identificate în grupul normal.
Diagrama Venn a proteinelor identificate din ambele grupuri; (A) prezintă proteinele identificate cu un singur peptid lovit. Total de 111 proteine împărțite între grupul PE și NC. (B) reprezintă proteinele care au multiple peptide unice. Șaptezeci și opt de proteine au fost împărțite în ambele grupuri.
Dintre cele 97 de proteine identificate confidențial, 78 au fost identificate în ambele grupuri. Pentru a selecta potențialii biomarkeri specifici fiecărui grup, nivelurile relative de expresie ale proteinelor identificate au fost comparate printr-o analiză semicantitativă bazată pe numărarea spectrală (Choi și colab., 2008; Little și colab., 2010). În cele din urmă, 62 de proteine au prezentat diferențe de peste 1,2 ori în nivelurile de expresie, dintre care 27 au fost reglate în sus și 35 din care au fost reglate în jos în funcție de numărul lor spectral (Tabelul 3).
Acele proteine identificate prin procedura de profilare cu 1% FDR au fost adnotate în continuare pe baza funcției lor moleculare și a procesului biologic în conformitate cu termenii ontologiei genetice (GO) în comparație cu proteomul seric de control dobândit din proiectul proteomului plasmatic HUPO (Adamski și colab.)., 2005; Omenn și colab., 2005) folosind instrumentul de adnotare funcțională panther (Thomas și colab., 2003).