Deficitul de kinază Per-Arnt-Sim (PASK) crește respirația celulară la o dietă standard și
Jenny A. Pape
Colleen R. Newey
Haley R. Burrell
Audrey Workman
Katelyn Perry
2 Departamentul de Fiziologie și Biologie a Dezvoltării, Universitatea Brigham Young, Provo, UT 84602, SUA; [email protected] (K.P.); ude.uyb@namkib_nimajneb (B.T.B.)
Benjamin T. Bikman
2 Departamentul de Fiziologie și Biologie a Dezvoltării, Universitatea Brigham Young, Provo, UT 84602, SUA; [email protected] (K.P.); ude.uyb@namkib_nimajneb (B.T.B.)
Laura C. Bridgewater
Julianne H. Grose
Date asociate
Abstract
1. Introducere
Diabetul și sindromul metabolic aferent sunt o epidemie din ce în ce mai mare în societatea actuală. În 2015, 9,4% din populația Statelor Unite avea diabet, iar estimarea sindromului metabolic era mult mai mare, la 30% [1,2,3]. Caracterizat printr-o combinație de tensiune arterială crescută, glicemie crescută, exces de grăsime corporală în jurul taliei și niveluri anormale de trigliceride, sindromul metabolic crește riscul de boli de inimă, accident vascular cerebral și diabet [1]. Rata crescândă a acestor boli se datorează parțial unei schimbări globale către alimente bogate în energie, bogate în grăsimi și cu un conținut scăzut de nutrienți, combinate cu o scădere a activității fizice [4]. Deoarece aceste modificări afectează corpul în ansamblu, ele provoacă, de asemenea, procesele celulare din corp, deoarece acesta încearcă să se adapteze noilor nutrienți și niveluri de activitate. Senzorii nutrienți joacă un rol esențial în adaptarea la aceste niveluri noi, monitorizând constant nutrienții celulari și reglând căile celulare pentru a menține homeostazia [5,6]. Când apare dereglarea în căile de detectare a nutrienților, se dezvoltă multe boli umane, cum ar fi diabetul și sindromul metabolic.
Aici caracterizăm efectele moleculare ale kinazei PAS asupra respirației și metabolismului trigliceridelor, precum și modul în care kinaza PAS modifică aceste căi ca răspuns la dietă și sex. Acest studiu a utilizat teste de respirație celulară, Western blot pentru abundența proteinelor în lanțul de transport al electronilor și abordări metabolomice trigliceridice. Pentru a determina efectul dietei la șoarecii PASK -/-, am investigat adăugarea de zahăr la dieta HF raportată anterior (o dietă bogată în grăsimi bogată în zahăr, dietă HFHS). Această dietă oferă condiții în care PAS kinaza poate fi mai activă (cu conținut ridicat de zahăr), reflectând în același timp mai precis dieta occidentală a societății actuale (cu conținut ridicat de zahăr și cu conținut ridicat de grăsimi [22]). În plus, luăm în considerare sexul (femelă versus șoareci de sex masculin) atunci când caracterizăm efectele moleculare ale kinazei PAS, care nu a fost raportată anterior. Aceste descoperiri vor ajuta la înțelegerea efectelor PAS kinazei, precum și a unei diete HFHS asupra metabolismului, aruncând lumină asupra căilor care contribuie la boli precum sindromul metabolic și diabetul.
2. Materiale și metode
Animale: C57BL/6 (Charles River Laboratories Wilmington, MA, SUA) Șoarecii PASK -/- au fost donați cu generozitate de Jared Rutter (Universitatea din Utah) și au fost descriși anterior [18]. Tipul sălbatic C57BL/6 au fost obținute de la Charles River Laboratories Wilmington, MA. Șoarecii de tip sălbatic masculin și feminin și șoareci PASK -/-, în funcție de vârstă, generați de șoareci de reproducere PASK +/−, au fost plasați pe o dietă HFHS (D12266Bi Condensed Milk Diet from Research Diets - 16,8% kcal protein, 31,8% kcal grass, 51,4 % kcal carbohidrați - în principal zaharoză, cazeină lactică și amidon de porumb) sau dietă normală (NC) (Teklad Rodent Diet 8604 de la Envigo - 32% proteine, 14% grăsimi, 54% carbohidrați - în principal făină de soia decorticat) la vârsta de 12 săptămâni și menținută pe dietă pentru un total de 25 de săptămâni. Șoarecii au fost cazați la cel mult 5 șoareci/cușcă în funcție de sex, genotip și dietă atribuită într-o casă de animale convențională. Hrana și apa erau disponibile în mod liber, iar șoarecii erau pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Brigham Young (numerele de protocol 13-1003 prezentate de L.C.B.).
Proiectarea studiului: Proiectarea s-a bazat pe caracterizarea șoarecilor masculi PASK -/- din dieta HF unde șoarecii au fost plasați în dieta HF la 12 săptămâni, iar 12-24 șoareci din fiecare grup au fost folosiți pentru a obține semnificația statistică a mai multor fenotipuri inclusiv greutatea corporală [18]. Studiul conține 8 grupe experimentale, inclusiv dieta WT NC masculină și feminină, dieta WT HFHS, dieta PASK +/− NC, dieta PASK +/− HFHS care au fost menținute în dieta HFHS timp de 25 de săptămâni înainte de recoltarea țesuturilor. Au fost necesari mai mulți șoareci de sex feminin decât femele din cauza țesuturilor limitate (cum ar fi țesutul hepatic pentru testul trigliceridelor comparativ cu testul consumului de oxigen). În figura S1 este prezentată o descriere a tuturor animalelor utilizate în acest studiu.
Testele de respirație: țesutul hepatic și mușchiul solei au fost recoltate și utilizate imediat pentru testele de respirație. Consumul de O2 a fost determinat utilizând un oxigraf O2K (Oroboros Instruments Corp., Innsbruck, Austria) așa cum s-a descris anterior [23]. Țesuturile au fost tocate cu un bisturiu și permeabilizate cu saponină (50 ug/ml). O rată de respirație de bază a fost determinată în fiecare cameră de respirație și apoi probele au fost adăugate. Respirația a fost măsurată urmând protocolul substrat-decuplare-inhibitor-titrare (SUIT): s-au adăugat glutamat, malat și succinat (GMS) pentru a evalua fluxul de electroni complex I și II. S-a adăugat apoi ADP (2,5 mM) pentru a determina capacitatea de fosforilare oxidativă (GMSD). În urma colectării datelor, analiza varianței cu trei factori (ANOVA) a fost efectuată utilizând software-ul JMP Pro14 cu testul post-hoc Tukey pentru comparații cu trei și doi factori și testul t pentru studenți pentru comparații cu un factor.
Testele trigliceridelor: Probele de ficat de șoarece au fost omogenizate în 110 pl de PBS-Triton. Nivelurile de trigliceride hepatice au fost măsurate folosind kitul colorimetric/fluorometric de cuantificare a trigliceridelor BioVision (Milpitas, CA, SUA) conform protocolului producătorului, iar absorbanța a fost măsurată la 530-590 nm. Concentrația de proteine a fost determinată utilizând reactivul de testare Pierce Coomassie Plus (Bradford) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA). ANOVA cu trei factori a fost efectuat utilizând software-ul JMP Pro14 cu testul post-hoc Tukey pentru analiza interacțiunii cu trei și doi factori și testul t pentru studenți pentru analiza cu un factor.
Analiză statistică: ANOVA cu trei factori a fost utilizat pe tot parcursul studiului pentru a analiza efectele sexului, genotipului și dietei, cu diferențe specifice enumerate pentru fiecare metodă. În cazul în care au fost utilizați doar șoareci masculi, ANOVA cu doi factori a fost utilizat pentru a analiza efectele genotipului și ale dietei. ANOVA factorială a fost efectuată folosind software-ul JMP Pro14 (versiunea 14.0) cu testul post-hoc Tukey utilizat pentru analiza cu trei factori (sex, genotip și dietă) și cu doi factori (sex și genotip, sex și dietă, genotip și dietă) și testul t al elevilor utilizat pentru analiza cu un singur factor (sex, genotip sau dietă). Analiza factorilor combinați este indicată prin „*”. De exemplu, „sex și genotip” este scris este sex * genotip.
3. Rezultate
3.1. Șoarecii cu deficit de kinază PAS prezintă o respirație crescută atunci când se iau o dietă normală Chow (NC)
Studiile anterioare au raportat un fenotip hipermetabolic pentru șoarecii PASK -/- pe o dietă HF, incluzând creșterea aportului de O2 la animale întregi și a producției de CO2 [9]. Acest fenotip se poate datora creșterii respirației în țesuturile periferice. Prin urmare, am măsurat ratele consumului de oxigen celular în mușchiul solei feminin și masculin, un mușchi compus în principal din fibre oxidative lente, precum și în țesutul hepatic feminin și masculin (Figura 1). Țesutul soleului atât al șoarecilor PASK -/- femele, cât și al celor masculi a prezentat o creștere tendențială a ratei de respirație bazală pe dieta NC comparativ cu șoarecii WT după analiza cu trei factori (sex, dietă, genotip). Au fost utilizate analize cu doi factori și un factor pentru a determina dacă vreun factor a contribuit în mod semnificativ la această creștere a tendințelor. Analiza cu doi factori utilizând factori combinați, cum ar fi sexul și genotipul (sexul * genotipul, sexul * dieta sau genotipul * dieta) nu au evidențiat nicio interacțiune semnificativă a factorilor, dar o analiză ulterioară cu un factor a relevat că genotipul PASK -/- a fost în principal responsabil pentru creșterea semnificativă a respirației (a