Defectul genetic sld
Biswadip Das
De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,
Melanie N. Cash
De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,
Bently Robinson
De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,
Christopher S. Kuhns
De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,
Lisa R. Latchney
§ Centrul de biologie orală, Universitatea din Rochester Medical Center, Rochester, New York 14642,
Margaret A. Fallon
§ Centrul de biologie orală, Universitatea din Rochester Medical Center, Rochester, New York 14642,
Rosemary W. Elliott
Departamentul de Biologie Moleculară și Celulară, Roswell Park Cancer Institute, Departamentul de Sănătate din New York, Buffalo, New York 14263 și
Arthur R. Hand
‖ Departamentele de Științe Craniofaciale și Biologie Celulară, Școala de Medicină Dentară, Universitatea din Connecticut Health Center, Farmington, Connecticut 06030
David J. Culp
De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,
§ Centrul de biologie orală, Universitatea din Rochester Medical Center, Rochester, New York 14642,
Date asociate
Abstract
Introducere
Mucinele sunt glicoproteine puternic glicozilate ale căror gene sunt desemnate ca MUC1 până la MUC22, pe baza ordinii lor de descoperire. Mucinele sunt grupate în trei familii: 1) mucine mari care formează gel și secretă, 2) mucine solubile și secretate și 3) mucine asociate membranei (1, 2). Mucinele mari care formează gel sunt formate din Muc2, Muc5ac, Muc5b, Muc6 și Muc19. Mucinele care formează gel sunt produse de secreție exocrină ale celulelor calice de suprafață și ale celulelor mucoase glandulare ale căilor respiratorii, ale tractului digestiv, ale sistemului urogenital, ale ochilor, urechii interne și ale sistemului salivar. Aceste mucine se polimerizează în rețele macromoleculare care conțin apă cu funcții de protecție, inclusiv hidratarea și lubrifierea suprafețelor țesuturilor, precum și interacțiunea cu agenții patogeni, fie singuri, fie ca parte a unor complexe moleculare mari cu alte molecule secretate în stratul de mucus (3, 4) . În saliva umană, MUC5B este bine recunoscut ca un constituent major al mucinei (5), iar transcrierile MUC19 sunt localizate în celulele mucoase ale glandelor salivare (6).
Ca o abordare alternativă în delimitarea mecanismelor care controlează expresia Muc19, am studiat modelul mouse-ului NFS/N-sld. Acești șoareci găzduiesc o mutație spontană autosomală recesivă, sld, caracterizată inițial ca dezvoltarea întârziată și limitată a celulelor mucoase în glandele salivare sublinguale (15-17). De atunci am demonstrat că mutația sld perturbă expresia Muc19, după cum reiese din studiile ultrastructurale și imunohistochimice, dar fără efecte asupra expresiei altor proteine secretate, precum și asupra expresiei proteinei globale (15). Deoarece Muc19 este singura mucină formatoare de gel a glandelor sublinguale, glandele neonatale ale șoarecilor sld sunt lipsite de granulele exocrine mari tipice fenotipului celulelor mucoase. Cu toate acestea, fenotipul celulelor mucoase începe să apară și să crească în număr de celule postnatal. Toate aceste celule exprimă Muc19, dar sunt restricționate deoarece celulele fenotipului celulelor mucoase reprezintă mai puțin de jumătate din populația de celule la vârsta de 1 an (15). În mod corespunzător, transcrierile Muc19 sunt abia detectabile, iar glicoproteinele Muc19 sunt nedetectabile la nou-născuții, deși ambele apar treptat postnatal coroborate cu apariția crescândă a celulelor fenotipului celulelor mucoase (15).
PROCEDURI EXPERIMENTALE
Materiale
Cu excepția cazului în care este indicat, toate sărurile și tampoanele de bază au fost de la Sigma, iar reactivii și kiturile moleculare, enzimele și reactivii de cultură au fost de la Invitrogen. Toate kiturile au fost utilizate conform instrucțiunilor producătorului.
Animale și colecția de glande
Universitatea din Florida, Universitatea din Cincinnati și Comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Universității din Rochester au aprobat toate procedurile pentru animale. Șoarecii NFS/NCr și NFS/N-sld provin din propriile colonii de reproducere menținute în condiții BSL2. Șoarecii NFS/NCr au fost obținuți inițial din programul pentru animale al Institutului Național al Cancerului (Charles River Laboratories, Frederick, MD). Șoarecii NFS/N-sld au fost obținuți inițial de la Institutul Central pentru Animale Experimentale (Kawasaki, Japonia) așa cum s-a descris anterior (15). Șoarecii au fost eutanasiați prin exsanguinare după narcoză cu dioxid de carbon. Dacă nu este indicat, toate țesuturile excizate au fost șterse pe hârtie de filtru, congelate rapid și depozitate în azot lichid. Pentru a determina greutatea umedă, țesuturile înghețate au fost cântărite rapid înainte de a fi utilizate cu o microbalanță Mettler MT-5 (Mettler Toledo, Columbus, OH).
Cartografierea genetică și RT-PCR a transcrierilor în regiunea critică
ADN-ul genomic a fost izolat din rinichi folosind trusa DNeasy (Qiagen). Markeri genomici polimorfi (site-uri marcate cu secvență (STS)) 3 au inclus STS-urile stabilite din Massachusetts Institute of Technology (MIT) și markeri STS D15Roc1-12 pe care le-am proiectat din repetiții simple genomice identificate de programul COMPILE_SIMPLE al serverului de adnotare a secvenței RUMMAGE . Localizarea cromozomială și dimensiunile ampliconului STS MIT sunt în tabelul suplimentar S1. Exemplele de secvențe, dimensiunile ampliconului, numerele de acces GenBank TM pentru D15Roc1-12 și condițiile PCR sunt date în tabelul suplimentar S2. Pentru fenotipul mutanților sld, omogenatele glandei sublinguale preparate din șoareci F2 la vârsta de 3 săptămâni au fost testate pentru prezența sau aproape absența (fenotipul mutant) a glicoproteinelor cu greutate moleculară mare.
Pentru a izola ARN-ul, țesuturile înghețate au fost omogenizate direct în reactiv TRIzol folosind un Mini Bead Beater 8 (Produse BioSpec, Bartlesville, OK) timp de 90 de secunde în prezența a ± 500 mg de bile de carbură de silicon (dimensiune 1 mm). ARN-ul a fost izolat conform instrucțiunilor producătorului și tratat cu DNază I folosind kitul de reactivi ADN-Ambion (Applied Biosystems, Foster City, CA). Puritatea ARN a fost evaluată prin electroforeză capilară (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Numărul de integritate ARN a variat între 8,7 și 9,5. ARN-ul tratat cu DNază I (5 μg) a fost transcris invers cu primeri aleatori utilizând trusa de arhivă de cADN de mare capacitate (Applied Biosystems), iar ADNc rezultat a fost purificat cu sistemul de purificare QIAquick PCR (Qiagen). ARN și ADNc au fost cuantificate utilizând kitul de testare ARN Quant-iT sau kitul de testare Quant-iT dsDNA HS cu fluorometrul Qubit. Condițiile PCR și primerii specifici utilizați pentru detectarea transcrierilor în intervalul critic sunt în tabelul suplimentar S3. Produsele PCR au fost confirmate prin secvențierea directă a benzilor purificate cu gel (QIAquick kit de extracție cu gel; Qiagen).