Creșterea Mycobacterium avium subsp
1 Laborator de bacteriologie, Grupul de sănătate animală, EEA INTA, 7620 Balcarce, Argentina
2 Facultad Ciencias Agrarias, UNMdP, CC 276, 7620 Balcarce, Argentina
3 Facultatea de Științe Veterinare, UNCPBA, Campus Universitario, Paraje Arroyo Seco, 7000 Tandil, Argentina
Abstract
1. Introducere
Mycobacterium avium subsp. paratuberculoză (MAP) este agentul cauzal al paratuberculozei sau al bolii Johne. MAP afectează animalele domestice și sălbatice și, la vaci, provoacă enterite cronice, diaree, scădere în greutate și emaciație progresivă care poate duce în cele din urmă la moarte [1]. MAP a fost, de asemenea, legată de boala Crohn umană, o tulburare sistemică care provoacă în principal o inflamație cronică a intestinului [2]. Se sugerează că oamenii ar putea fi infectați prin lapte contaminat, deși se știe relativ puțin despre supraviețuirea MAP în timpul manipulării laptelui industrial. Unii autori au sugerat că pasteurizarea este capabilă să distrugă micobacteriile. Astfel, s-au efectuat teste de laborator pentru a evalua rezistența la căldură MAP în funcție de distribuția diferențiată a tratamentului termic în timpul pasteurizării [3-6]. În contrast, alți autori susțin teoria conform căreia MAP este capabil să reziste pasteurizării atunci când este prezentă în laptele crud [7-13].
MAP viabil a fost detectat în laptele pasteurizat comercial din Marea Britanie, SUA, Republica Cehă și India [10, 11, 14-16]. Mai mult, în Republica Cehă, folosind F-57 sau IS900 PCR în timp real, MAP a fost detectată la 49% din probele de lapte praf pentru sugari, un studiu a dat MAP viabil [17].
Cu toate acestea, s-a publicat puțin despre MAP în produsele lactate, altele decât lichidul de lapte praf și o parte din brânză. În general, produsele lactate fermentate oferă bariere semnificative în calea creșterii agentului patogen, începând cu tratamentul termic în timpul pasteurizării, urmat de adăugarea unei culturi inițiale și a mediului de aciditate în timpul fermentării, precum și depozitare frigorifică. van Brandt și colab. a inoculat MAP în lapte cu temperatură foarte înaltă (UHT) și a observat că numărul inițial de MAP, în timpul fermentării iaurtului urmat de depozitare la 6 ° C, a rămas neschimbat timp de peste 6 săptămâni, indiferent de cultura de start care a fost utilizată sau de conținutul de grăsime din lapte [18 ].
Scopul acestui studiu a fost de a afla viabilitatea MAP, E coli, și . Enteritidis în timpul procesării tradiționale și păstrării la frigider a iaurtului obținut din lapte după inoculare experimentală și determinați dacă există efecte sinergice sau antagoniste între aceste bacterii.
2. Materiale și metode
2.1. Tulpini de bacterii
Tulpinile bacteriene au fost izolate la laboratorul de bacteriologie al Institutului Național de Tehnologie Agricolă (INTA), Balcarce (Argentina), folosind tulpina MAP INTA SB, izolată dintr-un lapte comercial, E coli tulpina INTA 116/C3, obținută din fecale bovine și S. Tulpina Enteritidis INTA 86/360, izolată de păsări de curte.
2.2. Pregătirea inoculelor
Pentru prepararea inoculului, tulpinile menționate anterior au fost decongelate din azot lichid. MAP a fost cultivat pe mediu solid de gălbenuș de ou Herrold (HEYM) plus 0,0002% (greutate/vol) micobactină J (Allied Monitor Inc., Fayette, MO, SUA) și piruvat de sodiu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SUA ) timp de 8 săptămâni la 37 ° C. Pentru pregătirea inoculului, puține colonii au fost suspendate în 15 ml de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (pH = 7), ajustată la turbiditatea de 0,5 la scara McFarland [25] conținând
unități care formează colonii
. E coli a fost cultivat pe agar McConkey (MC) și S. Enteritidis a fost cultivat pe agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato cu adăugarea de 0,46% de Tergitol-4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SUA) (XLDT4). Ambele agare MC și XLDT4 au fost incubate peste noapte la 37 ° C. După aceea, o colonie din oricare E coli sau S. Enteritidis a fost suspendat în PBS pH 7,2 și utilizat pentru a însămânța bulionul de infuzie creier-inimă (BHI) (Oxoid, Marea Britanie), care au fost incubate în continuare peste noapte la 37 ° C. Pentru prepararea inoculului ambele tuburi BHI au fost diluate cu PBS (pH = 7,2) până la o concentrație finală de unități care formează colonii .
2.3. Pregătirea iaurtului
Au fost preparate trei iaurturi tradiționale folosind 360 ml de lapte UHT comercial, 125 g de iaurt comercial care conține o cultură inițială de Streptococcus thermophilus și Lactobacillus bulgaricus, și 5 ml de inocul bacterian corespunzător: Iaurt 1 (Y1): HARTĂ, Iaurt 2 (Y2): E coli + S. Enteritidis și Iaurt 3 (Y3): HARTĂ + E coli + S. Enteritidis. Fermentarea a fost efectuată într-un agitator orbital termostatic (New Brunswick Scientific, Model E24) la 43 ° C timp de 3 ore. Ulterior, iaurturile au fost depozitate la 4 ° C timp de 20 de zile.
2.4. Mostre de iaurt
Probele de 50 ml au fost luate înainte și pe tot parcursul timpului de preparare la 20 min, 45 min, 65 min, 90 min, 115 min, 135 min, 155 min, 180 min și 270 min. Mai mult, probele au fost prelevate și în timpul depozitării la 4,5 ore, 24 ore, 48 ore, 4 zile, 10 zile, 15 zile și 20 de zile după inoculare.
2.5. Numărul de bacterii vii
HARTĂ. Pentru decontaminarea probelor, metoda propusă de Tacquet și colab. [26] a fost utilizat cu unele modificări: 35 ml din fiecare iaurt au fost centrifugați la 6000 rpm timp de 20 de minute într-o centrifugă frigorifică (Sigma 16-K, Germania) și peleta a fost resuspendată în 15 ml acid oxalic la 5% (greutate)/vol). Probele au fost menținute la 37 ° C timp de 10 minute și apoi centrifugate încă o dată. Ulterior, peleta a fost resuspendată în 2 ml PBS și în final 160 μL a fost cultivat în HEYM plus vancomicină 0,01% (greutate/vol), amfotericină B 5% (greutate/vol), acid nalidixic 0,3% (greutate/vol) și nistatină 0,01% (greutate/vol). Mediul a fost incubat la 37 ° C timp de 40 de zile și a fost observat săptămânal pentru creșterea MAP. CFU final a fost calculat luând în considerare faptul că fiecare înclinare a fost inoculată cu 160 μL. Rezultatele sunt exprimate ca de iaurt.