Creierul 5 - Expresia genei receptorului HT1A în hibernare - Naumenko - 2008 - Gene, creier și

Institutul de Citologie și Genetică

* V. Naumenko, Laboratorul de Neurogenomică Comportamentală, Institutul de Citologie și Genetică, Divizia Siberiană a Academiei Ruse de Științe, Bulevardul Lavrentyev 10, 630090 Novosibirsk, Rusia. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Institutul de biologie chimică și medicină fundamentală, divizia siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk

Institutul de Citologie și Genetică

Institutul de Biofizică Celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de biofizică celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de Citologie și Genetică

Institutul de biologie chimică și medicină fundamentală, divizia siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk

Institutul de Citologie și Genetică

Institutul de Biofizică Celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de biofizică celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de Biofizică Celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de Citologie și Genetică

Abstract

Hibernarea mamiferelor reprezintă un model unic pentru studiile mecanismelor care reglementează sistemele fiziologice, comportamentul și toleranța naturală la ischemie și hipotermie. Mecanismele creierului care sunt utilizate de hibernatori pentru a face trecerea de la starea normală, eutermică la hibernare caracterizată prin alterarea profundă a temperaturii corpului sunt de un interes deosebit. La veverița de pământ hibernantă, temperatura corpului scade până aproape de mediu, uneori până la 1,5-3 ° C și există o reducere concomitentă (până la 1-5% a ratei euterme) a ritmului cardiac, respirator și metabolic (Barnes 1989; Popova 1986). Creierul unui mamifer hibernant suportă extreme fiziologice care sunt mortale pentru nehibernatori. Identificarea genelor și a mecanismelor neurotransmițătorilor care stau la baza acestui comportament natural de adaptare este primul pas cheie către înțelegerea plasticității creierului și a mecanismului central pentru supraviețuire.

În ultimele decenii, au fost descrise 14 subtipuri diferite de receptori 5 - HT, care au fost împărțite în șapte familii pe baza caracteristicilor operaționale (legate de medicament), transductionale (cuplarea receptorilor) și structurale (secvența primară de aminoacizi). Toți receptorii 5 - HT, cu excepția unuia (tip 5 - HT3), sunt receptori cuplați cu proteine G metabotrope; distinct din punct de vedere structural și funcțional de toate celelalte tipuri de receptori 5 - HT, receptorul 5 - HT3 este receptor de canale ionice cu ligand ionotropic (Barnes & Sharp 1999).

Printre varietatea uimitoare de receptori 5 - HT clonați și identificați, o atenție deosebită s-a concentrat asupra receptorului 5 - HT1A datorită datelor privind implicarea sa în controlul anxietății (Heisler și colab. 1998; Nutt & Glue 1991), somn (Derry și colab. 2006; Wilson și colab. 2005) și hipotermie (Hjorth 1985; Overstreet și colab. 1996), sugerând că receptorul 5 - HT1A poate lua parte la menținerea hipotermiei profunde și a torpelor tipice pentru hibernare. În același timp, nu au existat date cu privire la creierul receptorilor 5 - HT1A în ciclul somn-veghe, precum și nu au existat informații despre gena receptorului 5 - HT1A la hibernatori.

Scopul prezentei lucrări a fost de a investiga expresia genei receptorului 5 - HT1A în creierul veverițelor solare hibernante în diferite etape ale ciclului somn - veghe. Nu au existat date cu privire la secvențele genei receptorului 5 - HT1A în veverița de pământ în bazele de date, astfel încât pentru a determina expresia receptorului, prima etapă a cercetării noastre a fost determinarea secvenței genei receptorului 5 - HT1A în veverița de pământ.

Materiale și metode

Subiecți de animale

Experimentele au fost efectuate pe veverițe de sex masculin (Spermophilus undulatus) cântărind 600-800 g. Animalele au fost prinse în Yakutia la sfârșitul lunii august. În Institutul de Biofizică, Academia Rusă de Științe, Pushchino, veverițele de pământ se aflau sub observație veterinară în vivariul special. Animalele au fost ținute individual în cuști de 35 × 40 × 20 cm, cu acces gratuit la alimente și apă. Lumina a fost aprinsă de la 0700 h la 1900 h. La sfârșitul lunii octombrie, animalele au fost plasate într-o cameră specială, cu o temperatură constantă care se apropia de condițiile naturale (+ 4 ° C). Experimentele au fost efectuate pe patru grupuri de veverițe la sol (10 animale în fiecare grup), decapitate în diferitele etape ale ciclului somn - veghe: (1) în iulie - animale active (temperatura corpului 37 ° C); (2) în octombrie - pregătit pentru hibernare, dar totuși animale euterme (temperatura corpului 37 ° C); (3) în ianuarie - animale hibernante (temperatura corpului 4 ° C) și (4) în aprilie - animale care ies din hibernare (temperatura corpului 28 ° C). Excitația a fost provocată prin transferul animalelor într-o cameră de laborator cu o temperatură ambiantă de 21-22 ° C. Temperatura corpului a fost măsurată în colon cu un termometru electric.

După o decapitare rapidă, creierele au fost îndepărtate pe gheață și apoi au fost izolate cortexul frontal, hipocampul și creierul mediu. Eșantioanele corticale din zonele simetrice ale regiunilor frontale bilateral (Schober 1986), toate hipocampul drept și partea caudală a trunchiului cerebral, inclusiv n. raphe dorsalis și n. raphe medianus (Konig & Klippel 1963), au fost luate. Structurile creierului au fost imediat înghețate în azot lichid și depozitate la -65 ° C până la extracția ARN.

Toate procedurile experimentale au fost realizate în conformitate cu Ghidul pentru conduită etică în îngrijirea și utilizarea animalelor (elaborat de Comitetul pentru cercetare și etică animală, 1991; http://www.apa.org/science/anguide.html).

Transcriptază inversă - reacție în lanț și secvențierea polimerazei

ARN-ul total a fost izolat folosind extracția cu tiocianat de guanidină, fenol și cloroform (Chomczynski & Sacchi 1987) cu modificări (Naumenko și Kulikov 2006). ARN-ul total obținut a fost depozitat în etanol 70% la -20 ° C pentru transfer la Institutul de Citologie și Genetică, Novosibirsk, iar apoi ARN-ul total a fost precipitat, uscat și dizolvat în apă tratată cu dietil pirocarbonat la o concentrație de 0,125 μg/μl și stocat la -65 ° C.

Transcrierea inversă a fost efectuată așa cum s-a descris în altă parte (Naumenko și Kulikov 2006). ADN-ul complementar sintetizat (ADNc) a fost stocat la -20 ° C.

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost efectuată folosind primerii direcționați către gena murină a receptorului 5 - HT1A în următoarele condiții: (1) 5 min la 94 ° C, 1 ciclu, (2) 40 secunde la 94 ° C, 40 de secunde la 59 ° C și 40 de secunde la 72 ° C, 36 de cicluri și (3) 4 min la 72 ° C, 1 ciclu (Tabelul 1).

Secvența genei nucleotidelor Temperatura de recoacere (° C) Dimensiunea produsului PCR (bp)

Gena receptorului 5 - HT1A murin	F 5 ′ - acttggctcattggctttctcat - 3 ′	59	602
	R 5′‐ ggcagccagcagaggatgaa - 3 ′
β-actină	F 5 ′ - cggaaccgctcattgcc - 3 ′	61	285
	R 5 ′ - acccacactgtgcccatcta - 3 ′
Veverițele la sol 5 - gena receptorului HT1A	F 5′‐ tactccactttcggcgctttctat - 3 ′	60	330
	R 5′‐ cagtggcaggtgctctttggagtt - 3 ′