Construirea de drojdii cu conținut scăzut de etanol - vin prin ștergerea parțială a Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Introducere

Materiale și metode

Tulpini, medii și condiții de creștere

Saccharomyces cerevisiae tulpini de laborator BY4741 (haploide, MAT A ; lui3Δ 1; leu2Δ 0; met15Δ 0; ura3Δ 0) și BY4743 (diploid, MAT A / MAT α his3Δ 1/his3Δ 1; leu2Δ0/leu2Δ 0; met15Δ 0/MET15; LYS2/lys2Δ 0; ura3Δ 0/ura3Δ 0) au fost utilizate pentru a construi mutanții și ca tulpini de control în timpul experimentelor de vinificare. Drojdia comercială de vin EC1118 (Lallemand, Danemarca) și tulpina nativă Mab2C selectată anterior în laboratorul nostru, au fost utilizate pentru a testa pdc2Δ519 mutație în mediile genetice native. Toate tulpinile de drojdie au fost crescute la 30 ° C și 150 rpm în mediu YPD (2% glucoză, 2% peptonă și 1% extract de drojdie). YPD suplimentat cu 200 mg/L de G-418 a fost utilizat pentru selectarea și întreținerea transformanților.

Construcția și integrarea genomică a pdc2Δ344 și pdc2Δ519 mutații

Curbele de creștere în mediul bogat YPD

Culturile de drojdie au fost inoculate în 10 ml YPD și crescute peste noapte. Aceste culturi au fost apoi utilizate pentru a inocula 50 ml de YPD în baloane Erlenmeyer de 100 ml la un OD600 inițial de 0,2 (Spectrofotometru UV - vizibil T60U PG Instruments, Leicestershire, Marea Britanie). Culturile au fost crescute cu 150 rpm la 30 ° C și alicote de 100 pl au fost luate la intervale diferite pentru măsurarea OD600.

Vinificări la scară de laborator

Analiza statistică a datelor

Un test ANOVA și un LSD Fisher cu valoarea ap $$> = D ^> \ left \> \ left [\ left (\ upmu _> * e)/D \ right) * (\ lambda-t) +1 \ right ] \ right \> $$

unde y = ln (ODt/OD0) OD0 este OD inițial și ODt este OD la momentul t; D = ln (ODmax/DO0) este curba maximă asimptotică, μmax este rata de creștere specifică maximă (1/h), iar λ este perioada fazei de întârziere (h). Datele despre creștere și cinetică au fost adaptate prin procedura de regresie neliniară, minimizând suma pătratelor diferenței dintre datele experimentale și modelul ajustat.

Rezultate

Creșterea haploidei și a diploidei pdc2Δ519 și pdc2Δ344 mutanți în condiții aerobe

scăzut

Creșterea tulpinilor parentale și mutante de laborator în YPD la 30 ° C și 150 rpm agitare. Fiecare punct reprezintă valoarea medie a două culturi independente

Cuantificarea parametrilor fermentativi din vinificările la scară de laborator și selectarea etanolului scăzut pdc2 mutanți

Pentru a selecta etanol scăzut pdc2 tulpini mutante, am efectuat o serie de microvinificări cu must concentrat diluat la 20 ° Bx și suplimentat cu 0,1% (greutate/volum) de extract de drojdie (Vazquez și colab. 2001). Au fost determinate concentrația de etanol, acid acetic, glicerol și zahăr rezidual și au fost calculați alți parametri fermentativi derivați, cum ar fi bilanțul de carbon și randamentul glucozei. Am căutat o tulpină mutantă cu o ușoară ineficiență pentru a produce etanol pentru a reduce conținutul de alcool din vin între 1 și 2% (v/v). În timpul primului experiment de vinificare (V1) haploid și diploid pdc2Δ519 mutanții au fost testați împotriva martorilor lor respectivi BY4741 și BY4743 (Tabelul 1). Având în vedere producția de etanol, BY4741pdc2Δ519 nu a prezentat nicio diferență statistică în comparație cu controlul, în timp ce BY4743pdc2Δ519 a prezentat o reducere semnificativă statistic a etanolului ( Tabelul 1 Parametrii fermentativi ai testelor de vinificare la scară de laborator în must alb de 20 ° Bx de către tulpini de drojdie de laborator părintești și mutante