Catalaza internă protejează virusul Herpes Simplex de inactivarea de peroxid de hidrogen
Abstract
S-a demonstrat că virusul Herpes simplex 1 (HSV-1) conține catalază, o enzimă capabilă să detoxifieze peroxidul de hidrogen prin transformarea acestuia în apă și oxigen. Studiile cu un inhibitor de catalază au indicat că catalaza asociată cu virusul poate avea un rol în protejarea virusului de inactivarea oxidativă. HSV-1 s-a dovedit a fi mai sensibil la uciderea prin peroxid de hidrogen în prezența unui inhibitor de catalază decât în absența acestuia. Rezultatele sugerează un rol protector pentru catalază în timpul petrecut de HSV-1 în mediul oxidant în afara unei celule gazdă.
Virușii experimentează medii destul de diferite, în funcție de faptul că se reproduc în interiorul unei celule gazdă sau în tranzit de la o gazdă la alta. În cadrul unei celule, virusul și componentele virusului sunt expuse unui mediu de reducere, unde potențialul redox este determinat în primul rând de glutation (18). În schimb, în afara unei celule, virusul este expus la oxigen și la produse toxice derivate din oxigen, cum ar fi peroxidul de hidrogen, superoxidul și radicalul hidroxil, specii reactive care au potențialul de a inactiva virusul. Pentru a face față compușilor extrem de reactivi, plantele și animalele exprimă enzime capabile să le transforme în produse netoxice. Exemple de astfel de enzime sunt catalaza, peroxidazele și superoxidul dismutaza (28). Aici, descriem rezultatele studiilor care demonstrează prezența catalazei în interiorul virionului purificat de herpes simplex. Testele au fost apoi efectuate pentru a determina dacă catalaza internă ar putea proteja virusul de inactivare prin H2O2.
Studiile de catalază au fost efectuate cu virusul herpes simplex 1 (HSV-1) care a fost crescut pe celule Vero în cultură și purificat prin centrifugare în gradient de densitate a zaharozei. Când suspensiile de virus au fost ajustate la 1% H2O2, au început să se formeze prompt bule de oxigen, indicând prezența catalazei (Fig. 1a, tubul stâng). Bulele au devenit evidente vizual după câteva secunde de incubare la temperatura camerei și au continuat să se formeze și să se mărească timp de cel puțin 20 de minute. Nu s-au format bule, totuși, dacă inhibitorul catalazei azidă de sodiu a fost adăugat la suspensia de virus înainte de tratamentul cu H2O2 (Fig. 1a, dreapta). Testele au fost, de asemenea, negative atunci când (i) virusul a fost îndepărtat din soluție prin centrifugare înainte de adăugarea de H2O2 sau (ii) capsidele HSV-1 (capsidele B) au fost înlocuite cu virusul intact. În teste similare, bulele care indică prezența catalazei nu au fost observate cu virusul stomatitei veziculare purificate sau cu adenovirusul 2 uman (datele nu sunt prezentate). Analiza Western blot a confirmat prezența unei catalaze asociate cu virusul HSV-1, dar nu cu adenovirusul, virusul stomatitei veziculare (VSV) sau capsidele HSV-1 A (Fig. 1b).
Au fost efectuate experimente de control pentru a confirma că catalaza a fost asociată cu HSV-1 și nu cu impuritățile prezente în prepararea virusului. HSV-1 purificat a fost centrifugat într-o bandă pe un gradient de densitate zaharoză, gradientul a fost fracționat și analiza Western blot a fost utilizată pentru a testa fracțiile de gradient individuale pentru prezența catalazei. Rezultatele au arătat că catalaza a fost prezentă în fracțiile care conțin virus, dar nu și în cele flancante (Fig. 1c). Rezultatele sunt interpretate pentru a indica faptul că catalaza este asociată cu HSV-1 și nu cu contaminanți, cum ar fi bacteriile care conțin catalază sau materialele celulei gazdă în prepararea virusului. Deoarece genomul HSV-1 nu codifică catalaza (22), enzima asociată cu virusul trebuie derivată din celula gazdă. Studiile timpurii ale virusului vaccinia au demonstrat prezența catalazei în interiorul virionului matur (8). În afară de această observație, nu cunoaștem niciun alt raport al catalazei ca componentă a unei structuri de virus.
O definiție mai precisă pentru localizarea catalazei a fost obținută prin tratarea virusului purificat cu detergentul neionic Triton X-100 (TX-100). Atunci când este efectuat cu virus proaspăt, acest tratament determină pierderea membranei virusului, a glicoproteinelor membranei și a aproape tuturor celor 20 sau mai multe proteine tegumentare (toate cu excepția UL36, UL37 și US3) (13, 21, 27). Cu toate acestea, capsida își păstrează integritatea și niciuna dintre proteinele majore ale capsidei nu se pierde. Virusul ADN este reținut în interiorul capsidei. Experimentele au implicat tratamentul HSV-1 cu 1% TX-100 și izolarea capsidelor rezultate prin centrifugare în gradient de densitate a zaharozei. Analiza Western blot a fost apoi utilizată pentru a testa capsidele pentru prezența catalazei. Rezultatele au demonstrat că glicoproteinele virusului și proteinele tegumentare au fost îndepărtate așa cum era de așteptat și că și catalaza a fost îndepărtată (vezi Fig. 2a, benzile 4 și 5). Acest experiment este interpretat pentru a indica faptul că catalaza este prezentă în tegumentul HSV-1.
Informații precum cele prezentate în Fig. 2 poate fi utilizat pentru a determina numărul de molecule de catalază per virion HSV-1 (15). Această măsurare a fost efectuată începând cu două alicote identice ale virusului purificat. Cele două au fost utilizate pentru a determina (i) numărul de molecule majore de proteină capsidă (UL19) dintr-un gel colorat în albastru Coomassie și (ii) numărul de molecule de catalază 60-kDa dintr-un Western blot calibrat. Într-o determinare reprezentativă, această analiză a dat o valoare de 1: 207,5 pentru raportul molar de catalază la UL19. Deoarece există 955 molecule UL19 per capsidă HSV-1, numărul moleculelor de catalază per capsidă a fost determinat a fi 955/207,5 sau 4,6. O a doua determinare similară a dat o valoare de 7,1 molecule de catalază. Deoarece există patru subunități de 60 kDa într-o moleculă activă de catalază (11, 20), rezultatele indică prezența a 1 până la 2 tetrameri de catalază per virion.