Caracterizarea pierderii genetice a funcției Fus la peștele zebră

Svetlana Lebedeva

Institutul de Biologie Moleculară, Mainz, Germania

António M. de Jesus Domingues

Institutul de Biologie Moleculară, Mainz, Germania

Falk Butter

Institutul de Biologie Moleculară, Mainz, Germania

René F. Ketting

Institutul de Biologie Moleculară, Mainz, Germania

Date asociate

ABSTRACT

Proteina de legare a ARN-ului FUS este implicată în transcriere, îmbinarea alternativă a genelor neuronale și repararea ADN-ului. Mutațiile din FUS au fost legate de boli neurodegenerative umane, cum ar fi SLA (scleroză laterală amiotrofică). Am întrerupt genetic fusul din zebră (Danio rerio) folosind sistemul CRISPR-Cas9. Animalele knockout fus sunt fertile și nu au prezentat niciun fenotip distinctiv. Mutația fusului induce modificări ușoare în expresia genelor la nivelul transcriptomului și proteomei din creierul adult. Am observat o influență semnificativă a fondului genetic asupra expresiei genelor și a utilizării 3'UTR, care ar putea masca efectele pierderii Fus. Spre deosebire de morfanții fus publicați, mutanții fizi zigotici materni nu prezintă degenerescență motoneuronală și prezintă activitate locomotorie normală.

Abrevieri

Introducere

Rezultate

Fus alele knockout în pești zebră

Am folosit tehnologia CRISPR-Cas9 24 pentru a întrerupe gena fus zebrafish cu un singur ARN ghid care vizează exonul 3 (Fig. 1A). Toate analizele ulterioare au fost efectuate pe alela care șterge 8 perechi de baze, rezultând un schimb de cadre și un codon de oprire prematur (alela „Δ8”) (Fig. 1A, B). ARNm de 8 fuz era încă prezent la animalele eliminabile, deși era de aproximativ 2 ori mai puțin abundent decât ARNm în greutate (Fig. 1C). Anticorpii publicați folosiți pentru a detecta proteina Fus din peștele zebră pe Western blot 21 nu au reușit să detecteze Fus în embrionii de tip sălbatic din mâinile noastre (neprezentat). Prin urmare, am folosit spectrometria de masă (MS) pentru a determina dacă ARNm de fus8 fus era încă capabil să producă proteine. Pentru a minimiza o posibilă contribuție de proteine ​​depuse matern, am analizat embrioni de 5 zile dintr-un incruciș heterozigot. Nu au fost detectate peptide unice proteinei Fus în niciunul dintre cele 4 replicate ale embrionilor fus -/-, în timp ce 2 peptide unice Fus au fost prezente în ¾ replicatele fraților de tip sălbatic (Tabelul 1). Această analiză ne-a condus la concluzia că proteina Fus nu a fost produsă și alela fus Δ8 este o mutație a pierderii funcției.

Generarea și validarea peștilor zebră fus knockout. (A) alele fuzibile generate de CRISPR-Cas9. O captură de ecran din browserul genomului UCSC prezintă secvențe aliniate de la animale F1 heterozigoți. Site-ul țintă CRISPR din fusul exon 3 este subliniat cu roșu. (B) Un exemplu de gel PAGE pentru genotiparea alelei Δ8. M = Marker cu greutate moleculară mică. Produsele de tip sălbatic (75bp) și fus -/- (67bp) pot fi discriminate. (C) Cuantificarea ARNm fus în raport cu ARNm WT la embrioni 5dpf. (D) Morfologia normală a WT și a embrionului fus -/- la 6 d post fertilizare (dpf). Bara de măsurare este de 1 mm.

tabelul 1.

Identificarea Fusului prin spectrometrie de masă (MS). Peptidele unice pentru proteina Fus au fost identificate numai în analiza SM a embrionilor WT 5dpf și a creierului adult, dar nu și în eliminarea Fus. Cross (x) înseamnă că peptida a fost identificată în proba respectivă. Mai jos: secvența proteică completă Fus, peptidele detectate unice pentru Fus sunt îndrăznețe și subliniate.

Genul mai sălbatic				picior -/-
Probă	Secvenţă	repl. 1	repl. 2	repl. 3	repl. 4	repl. 1	repl. 2	repl. 3	repl. 4
Embrion	AAIDWFDGKDFNGNPIK	X
	TGLPMINLYTDR	X	X
Creier	AAIDWFDGKDFNGNPIK	X	X	X	X
	CSNPSCGNLNFSWR	X	X	X
	TGLPMINLYTDR	X

MASNDYGQTSSHGYGGYGGQSGQSYSQPSAQNYSQQSYGGYNQSSESSSAPYNQGGYSSNYGQSQSGGYGSQAPSQGYSQSSQSYSSGGYSNTSQPPPAQSGGYSQQSSYSGYNQSSPASAPGGYSSSSQSSGYGQQQQQSGGGYGGSGGQSGGYGSSGGQSSGFGGSGGQHQSSQSGGGSYSPSPNYSSPPPQSYGQQSQYGQGGYNQDSPPMSGGGGGGGYGGQDGGYSQDGRGGRGRGGGFGGRGAGGFDRGGRGGPRGRGGMGMGDRGGFNKFGGPRDHGAGGPNMQEQDNSDNNTIFVQGLGDDYTVDSVADYFKQIGIIKVNKKTGLPMINLYTDRETGKLKGEATVSFDDPPSAKAAIDWFDGKDFNGNPIKVSFATRRAEFGRGGSSGGMRGGRGRGGPMGRGGFGGGGGGGGGGGGFQGNNGGGSGNGGGQQRAGDWKCSNPSCGNLNFSWRNECNQCKEPKPEGSGGGMSPMGGGFGGERGRSGFDRGGFRGRGGDRGGFRGGRGGDRGGFGPGKMDSRGDHRHDRRDRPY

---