Analiza fiziologică și transcriptomică a orezului indica „MH86” supraexprimând OsSPL14 bioRxiv
Abstract
A sublinia Plantele transgenice cu supraexpresie OsSPL14 au prezentat o perioadă de creștere mai scurtă, frunze de steag scurte și înguste și frunze verzi groase. Profilul transcript, nivelul acidului abscisic (ABA) și al acidului giberelinic (GA3), precum și compoziția culmului s-au schimbat, de asemenea, în mod evident.
Introducere
OsSPL14 este membru al genelor SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL). Genele SPL codifică factori de transcripție specifici plantelor care conțin un domeniu de legare a ADN-ului care conține ion de zinc foarte conținut, cunoscut sub numele de SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN [SBP] -box (Yamasaki și colab., 2004). SPB1 și SPB2 au fost genele SPL originale identificate în Antirrhinum majusas care se leagă de promotorul genei de identitate a meristemului floral SQUAMOSA (Klein și colab., 1996).
Multe gene SPL conțin un situs țintă de miARN (microARN), inclusiv miR156/157, iar situsurile țintă sunt situate în regiunile de codificare sau regiunea 3 'netradusă (3' UTR). În Arabidopsis thaliana, 10 din 16 gene SPL s-au prezis a fi ținte ale miR156 (Rhoades și colab., 2002; Schwab R și colab., 2005). SPL3, SPL4 și SPL5 au un site țintă pentru miR156 în UTR de 3 ′ și sunt puternic reprimate de miR156. Supraexprimarea SPL3 a accelerat înflorirea și plantele care exprimă SPL3 conținând situl țintă miR156 mutat sau fără situl țintă miR156 au apărut înflorire anterioară și mai puține frunze (Cardon și colab., 1997; Wu și Poethig, 2006; Gandikota și colab., 2007). În plus, genele paralogice SPL9 și SPL15 cu situl țintă miR156 implicate în controlul tranziției fazei juvenil-adulte și mutanții dubli spl9 spl15 au prezentat plastocron scurtat, arhitectura inflorescenței modificate și ramificarea îmbunătățită (Schwarz și colab., 2008; Wang și colab., 2008). În plus, SPL8 fără site-uri țintă miARN a afectat megasporogeneza, formarea trichomului pe sepale și alungirea filamentului de stamină (Unte și colab., 2003). În consecință, o serie de studii privind gena SPL în Arabidopsis thaliana au sugerat că genele AtSPL asociate în principal cu dezvoltarea și înflorirea plantelor.
În acest studiu, am introdus OsSPL14 în cultivarul indica „MH86” și am obținut linii transgenice care supraexprimă OsSPL14 cu o perioadă de creștere mai scurtă, frunze de steag scurte și înguste, cu un număr mai redus de timon, cu vânt puternic. Analiza transcriptomului a indicat faptul că genele implicate în biosinteza carotenoidelor și în biosinteza ligninei au fost reglate în sus în planta transgenică. Nivelurile de ABA și GA3 s-au îmbunătățit, iar conținutul de lignină, celuloză, siliciu și potasiu a crescut evident. Luate împreună, aceste descoperiri completează descrierea funcției OsSPL14.
Materiale și metode
Generarea orezului transgenic
Plasmida pCAMBIA1300-OsSPL14 (Fig. Suplimentară S1; OsSPL14/IPA1: GenBank GU136674.1, 7229 bp care conține promotorul și regiunea de codificare pentru ARNm) a fost introdusă în embrioni de orez matur (cultivar Oryza sativa L.indica „MH86”) folosind Agrobacterium -transformare mediată așa cum este descris de Datta (1997). Celulele transformate au fost selectate inițial pe mediu NB (Sivamani și colab., 1996) conținând 50 mg/L higromicină (SIGMA-ALORICH). După 3-4 cicluri de selecție cu o durată de 14 zile pe ciclu, grupurile de celule supraviețuitoare au fost regenerate. Plantele care au fost generate au fost selectate în continuare în soluția de cultură conținând 20 mg/L higromicină cu o perioadă de 16 ore la 26 ° C timp de 4 săptămâni și apoi transferate într-o seră și crescute cu plante WT sub lumina soarelui naturală.
ADN-ul genomic a fost preparat din plantele rezistente la bialafos prin metoda bromurii de cetiltrimetilamoniu (CTAB) și utilizat ca model pentru reacția în lanț a polimerazei (PCR) și analiza Southern blot. Prezența genei introduse în plantele regenerate a fost verificată prin PCR folosind grundurile Hygromycin F/R. Un total de 100 μg ADN per probă a fost digerat peste noapte cu enzimă de restricție EcoRI la 37 ° C. ADN-ul digerat a fost fracționat în geluri TAE-agaroză 1% (g/v) și apoi transferat la o membrană de nailon Hybond-N (Amersham, Arlington Heights, IL, SUA), conform instrucțiunilor producătorului. O secvență parțială de genă Hygromycin a fost izolată din plasmidă și marcată folosind un kit de etichetare directă AlkPhos (Amersham) pentru a realiza sondele de hibridizare. Apoi fragmentele de ADN de pe membrana de nailon Hybond-N au fost hibridizate cu sonda Hygromycin.
ARN-ul total a fost izolat din plante PCR pozitive și WT folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, SUA). ADNc de prima catenă a fost sintetizat din 2 μg de ARN total utilizând kitul de sinteză ADN-ul de catenă RevertAid ™ (Fermentas, LTU) urmând instrucțiunile producătorului. Reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR) a fost efectuată folosind grunduri Hygromycin F/R și Actin150 F/R.
Plantele transgenice au fost cultivate într-un câmp experimental transgenic. Și plante transgenice moștenite stabil care posedă două copii ale transgenului au fost selectate și utilizate în acest studiu.
Secvențierea ARN și analiza transcriptomului
Pe baza informațiilor de localizare a citirilor mapate, nivelurile de expresie genică au fost calculate de către componentele cuffquant și cuffnorm ale software-ului cufflinks folosind fragmente pe kilobază de transcriere la milion de fragmente mapate (FPKM) ca indice de măsurare. Conform standardului de screening pentru modificarea pliurilor (FC) ≥2 și rata de descoperire falsă (FDR) Analiza fenotipului plantei. (A) Arhitectura vegetală a plantei sălbatice MH86 și OE: plantă transgenică OsSPL14. (B) Caracter morfologic al frunzei. (C) Lungimea frunzei pavilionului. (D) Lățimea frunzei pavilionului. (E) Numărul lucrătorilor. (F) Diametrul internodului antepenultim. (G) Grosimea peretelui internodului antepenultimat. (H) Înălțimea plantei. (I) Clorofila a, clorofila b și conținutul de carotenoizi al frunzei în stadiul de însămânțare. (J) Clorofila a, clorofila b și conținutul de carotenoizi din frunza steagului în stadiul de maturitate. Bara = 5 cm. (* P≤0,05, ** P≤0,01, *** P≤0,001).