Adipogeneza în obezitate necesită o interacțiune strânsă între diferențierea adipocitelor, celulele stromale
Abstract
OBIECTIV - Extinderea masei țesutului adipos observată în obezitate implică atât hiperplazie, cât și hipertrofie a adipocitelor. Cu toate acestea, se știe puțin despre modul în care adipocitele, precursorii adipocitelor, vasele de sânge și celulele stromale interacționează între ele pentru a realiza adipogeneza.
PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE - Am dezvoltat o metodă confocală bazată pe microscopie de vizualizare tridimensională a țesutului adipos viu intact care ne permite să evaluăm simultan angiogeneza și adipogeneza la șoareci db/db.
REZULTATE - Am constatat că diferențierea adipocitelor are loc în grupuri de celule (pe care le-am desemnat grupuri de celule adipogene/angiogene) care conțin mai multe tipuri de celule, inclusiv celule endoteliale și celule stromale care exprimă CD34 și CD68 și leagă lectina. Au existat strânse relații spațiale și temporale între formarea vaselor de sânge și adipogeneză, iar încolțirea noilor vase de sânge din vasculatura preexistentă a fost cuplată cu diferențierea adipocitelor. Celulele care leagă lectina CD34 + CD68 + ar putea fi distinse clar de macrofagele CD34 - CD68 +, care au fost împrăștiate în stromă și nu au legat lectina. Clusterele de celule adipogene/angiogene pot fi distinse morfologic și imunohistochimic de structurile asemănătoare coroanei, frecvent observate în etapele târzii ale obezității țesutului adipos. Administrarea anticorpilor factorului de creștere endotelial anti-vascular (VEGF) a inhibat nu numai angiogeneza, ci și formarea de grupuri de celule adipogene/angiogene, indicând faptul că cuplarea adipogenezei și angiogenezei este esențială pentru diferențierea adipocitelor în obezitate și că VEGF este un mediator cheie a acestui proces.
CONCLUZII - Tehnicile de imagistică a țesuturilor vii oferă dovezi noi ale interacțiunilor dinamice dintre diferențierea adipocitelor, celulele stromale și angiogeneza în țesutul adipos obez viu.
PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII
O versiune extinsă a secțiunii de proiectare și metode de cercetare este disponibilă în apendicele online „Materiale și metode” (disponibil la http://dx.doi.org/10.2337/db06-1749).
Imagistica țesutului viu.
Șoarecii db/db în vârstă de 8 săptămâni au fost separați în două grupe: un grup db/db + factor de creștere endotelială vasculară (VEGF) (căruia i s-a administrat subcutanat un anticorp monoclonal anti-VEGF [100 μg/șoarece] timp de 2 săptămâni înainte de experimentare) și un grup de control db/db (care a primit IgG nespecific).
Șoarecii au fost uciși prin luxație cervicală, după care grăsimea epididimală a fost îndepărtată folosind tehnici sterile și tocată în bucăți mici (∼2-3 mm) folosind un bisturiu. Bucățile de țesut au fost apoi spălate și incubate cu FM1-43, BODIPY, LDL acetilat conjugat cu Alexa Fluor sau Griffonia simplicifolia isolectin GS-IB4 conjugat cu Alexa Fluor. Nucleii au fost contracolorați cu Hoechst 33342.
Griffonia simplicifolia IB4 izolectina este o sondă histochimică utilă care etichetează în mod specific celulele endoteliale în multe specii și țesuturi, inclusiv țesutul adipos (19). Am confirmat aceste constatări prin dubla colorare a țesutului adipos cu anti-CD31 (moleculă de adeziune a trombocitelor/celule endoteliale) și lectină, care au produs modele de colorare identice (apendicele online Fig. 1).
Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de etică pentru experimente pe animale ale Universității din Tokyo și au respectat cu strictețe liniile directoare pentru experimentele pe animale ale Universității din Tokyo.
Microscopie confocală.
A fost utilizat un microscop confocal cu scanare laser (CSU22; Yokogawa-denki și LSM510 Meta; Carl Zeiss). Țesutul a fost excitat folosind linii laser cu mai multe culori și emisia a fost colectată prin intermediul filtrelor de bandă înguste adecvate. Fiecare imagine a fost produsă dintr-o medie de opt cadre, după care imaginile achiziționate au fost procesate pentru a produce un model tridimensional redat la suprafață.
Folosind acestea din urmă, am confirmat că fiecare adipocit din țesutul adipos este înconjurat de microvase care utilizează stive groase de 50 - μm, dar am găsit dificil să vizualizăm detaliile precise ale structurilor din cauza focalizării insuficiente în feliile profunde. Prin urmare, am ales să folosim în principal stive de + celule fără întreruperea membranei plasmatice. Histograma prezentată a fost construită din 1.000 de celule din fiecare grup. Pentru a calcula numărul de adipocite din plăcuțele de grăsime epididimale, volumul de grăsime a fost împărțit la numărul de celule determinat pe unitate de volum.
Pentru a cuantifica numărul de clustere de celule adipogene, au fost luate patru felii la intervale spațiale regulate din fiecare tampon de grăsime epididimală și au fost examinate imagini cu cinci câmpuri de putere redusă colorate cu BODIPY și lectină pentru fiecare felie. Au fost analizate patru animale în fiecare grup (un total de 80 de câmpuri de putere redusă pentru fiecare grup). S-a determinat numărul de clustere de celule adipogene/angiogene (definit prin prezența unor adipocite mici înconjurate de celule care leagă lectina și de vase de sânge). Am analizat cel puțin cinci câmpuri pe felie și patru felii pe masă de grăsime pentru a obține imagini reprezentative.
În experimentele preliminare, am confirmat că țesutul adipos a fost omogen din punct de vedere structural prin examinarea tampoanelor de grăsime la intervale spațiale regulate în db/+, iar grupurile celulare adipogene au fost, de asemenea, distribuite omogen în toate secțiunile luate din diferite părți ale tampoanelor de grăsime epididimale șoareci db/db (Apendice online Fig. 3).
Colorarea imunofluorescentă a bromodeoxiuridinei încorporate.
Șoarecilor li s-a administrat bromodeoxiuridină intraperitoneală (BrdU) (30 mg/kg corp greutate) cu 2 zile înainte de a fi uciși. Ulterior, țesutul adipos rezecat a fost fixat, permeabilizat, tratat cu dezoxiribonuclează și incubat cu izotiocianat de fluoresceină - anticorpi anti-BrdU conjugați.
Imunohistochimie.
Pentru analiza imunohistochimică, piesele de țesut izolate au fost fixate în 4% formaldehidă și permeabilizate cu 1% Triton X-100. Probele au fost apoi blocate cu 1% BSA și incubate cu o pereche de anticorpi primari și apoi cu un anticorp secundar. Anticorpii, coloranții, furnizorii, timpul de incubație și concentrația utilizate în prezentul studiu sunt rezumate într-un tabel de apendice online.