Tehnica de polimorfizare a lungimii fragmentului de restricție (RFLP); Știri-Medical
Polimorfismul de lungime a fragmentului de restricție (RFLP) este o tehnică inventată în 1984 de omul de știință englez Alec Jeffreys în timpul cercetării bolilor ereditare. Este folosit pentru analiza tiparelor unice din fragmentele de ADN pentru a diferenția genetic între organisme - aceste tipare se numesc Număr variabil de repetiții tandem (VNTR).
Polimorfismul genetic este definit ca diferențele genetice moștenite dintre indivizi în peste 1% din populația normală. Tehnica RFLP exploatează aceste diferențe în secvențele ADN pentru a recunoaște și studia atât variația intraspecie, cât și cea interspecială.
Principiu
Endonucleazele de restricție sunt enzime care taie ADN-ul lung în bucăți scurte. Fiecare endonuclează de restricție vizează secvențe de nucleotide diferite într-o catenă de ADN și, prin urmare, taie la diferite situri.
Distanța dintre locurile de clivaj ale unei anumite endonucleaze de restricție diferă între indivizi. Prin urmare, lungimea fragmentelor de ADN produse de o endonuclează de restricție va diferi atât între organisme individuale, cât și specii.
Cum functioneazã?
RFLP se realizează utilizând o serie de pași descriși pe scurt mai jos:
Extragerea ADN-ului
Pentru început, ADN-ul este extras din sânge, salivă sau alte probe și purificat.
Fragmentarea ADN-ului
ADN-ul purificat este digerat folosind endonucleaze de restricție. Siturile de recunoaștere ale acestor enzime au în general 4 până la 6 perechi de baze în lungime. Cu cât secvența este mai scurtă, cu atât este mai mare numărul de fragmente generate din digestie.
De exemplu, dacă există o scurtă secvență de GAGC care apare în mod repetat într-o probă de ADN. Endonucleaza de restricție care recunoaște secvența GAGC taie ADN-ul la fiecare repetare a modelului GAGC.
Dacă o probă repetă secvența GAGC de 4 ori în timp ce o altă probă o repetă de 2 ori, lungimea fragmentelor generate de enzimă pentru cele două probe va fi diferită.
Electroforeză cu gel
Fragmentele de restricție produse în timpul fragmentării ADN-ului sunt analizate utilizând electroforeza pe gel.
Fragmentele sunt încărcate negativ și pot fi ușor separate prin electroforeză, care separă moleculele în funcție de mărimea și sarcina lor. Probele de ADN fragmentate sunt plasate în camera care conține gelul electroforetic și doi electrozi.
Când se aplică un câmp electric, fragmentele migrează spre electrodul pozitiv. Fragmentele mai mici se mișcă mai repede prin gel, lăsându-le pe cele mai mari în urmă și astfel probele de ADN sunt separate în benzi distincte pe gel.