Starea blocată de tubulină a VDAC studiată prin polimerizare și partiționare ATP
Date asociate
Abstract
Interacțiunea funcțională raportată recent între canalul anionic dependent de tensiune al membranei mitocondriale externe, VDAC și tubulina dimerică a fost observată ca un blocaj al canalului reversibil. Folosind partiționarea poli- (etilen glicolului) de diferite greutăți moleculare și măsurători de inversare a potențialului, vom testa dimensiunea și selectivitatea ionică a stărilor complet deschise și blocate de tubulină ale VDAC reconstituite în straturi de lipide planare. În timp ce raza efectivă a canalului scade doar cu un factor de 1,34 ± 0,15, selectivitatea se inversează de la inițial anionic la cationic. Măsurând direct partiționarea ATP, demonstrăm că aceste modificări interzic accesul ATP în canal în starea sa blocată cu tubulină.
1. Introducere
Una dintre cele mai abundente proteine din citosolul majorității celulelor eucariote, tubulina dimerică, sa dovedit recent a fi un inhibitor puternic al canalului anionic dependent de tensiune al membranei mitocondriale exterioare, VDAC [1, 2]. Interacțiunea tubulină-VDAC este văzută ca tranziții reversibile ale canalului, reconstituite în membrane lipidice plane, între stările sale deschise și blocate de tubulină. Inhibarea este foarte sensibilă la tensiune și, în funcție de potențialul membranei externe mitocondriale, ar putea necesita concentrații micro-molare până la nano-molare de tubulină. Experimentele cu mitocondrii izolate sugerează că interacțiunea VDAC-tubulină este importantă din punct de vedere funcțional în reglarea respirației mitocondriale [2, 3]. Starea blocată cu tubulină este încă extrem de conductivă la ioni (aproximativ 40% din conductanța în stare deschisă în 1 M KCl), ceea ce poate implica faptul că inhibarea VDAC de către tubulină este limitată de valoarea acestei conductanțe reziduale. Cu toate acestea, se crede că rolul major al VDAC este reglarea schimbului de ATP/ADP [4-6] și nu fluxul de ioni mici, deci ceea ce este cu adevărat important este efectul blocării tubulinei asupra transportului nucleotidic.
Există o listă lungă de diferiți compuși care afectează tensiunea VDAC (vezi [4, 5, 7]) în care polianionii, cum ar fi polianionul Konig și sulfatul de dextran, sunt cei mai puternici inhibitori ai VDAC [8, 9]. În special, s-a demonstrat că polianionul lui Konig inhibă transportul de nucleotide adeninice în mitocondriile izolate [8] și celule [10]. Cu toate acestea, acțiunea de reglementare a tubulinei a fost recunoscută doar foarte recent [2, 11]. Pentru a înțelege semnificația funcțională a interacțiunii VDAC-tubulină, investigăm proprietățile biofizice majore ale stării blocate de tubulină.
În prezentul studiu aplicăm trei abordări pentru a evalua caracteristicile funcționale ale stării blocate. Mai întâi estimăm schimbarea razei caracteristice a VDAC la blocarea acestuia de către tubulină folosind partiționarea polimerului în canal [12, 13] în ambele state. O listă exhaustivă de referință referitoare la această abordare poate fi găsită într-o publicație recentă din laboratorul nostru [14]. Esența abordării este de a analiza pătrunderea poli (etilen glicolului) de dimensiuni diferite, PEG, în canalul porilor umpluți cu apă prin măsurarea conductanței sale în prezența acestor polimeri. Conductanța canalului răspunde diferit la PEG-uri cu greutate moleculară diferită, cu polimeri care sunt suficient de mici pentru a se împărți în por, reducându-i conductanța într-un mod dependent de greutate. Pe baza greutății moleculare caracteristice a polimerului care separă partiția de excludere, concluzionăm că aria secțiunii transversale efective a canalului este redusă cu un factor de doi ca urmare a blocării.
În al doilea rând, analizăm schimbarea indusă de blocaj în selectivitatea canalului de ioni mici la concentrații de sare apropiate de fiziologice. Arătăm că selectivitatea canalului își inversează semnul: de la selectivitatea predominant anionică în stare deschisă trece la selectivitatea cationică în cea blocată cu tubulină.
În al treilea rând, estimăm partiția ATP atât în canal deschis, cât și în canalul blocat cu tubulină. Constatăm că, în timp ce în stare deschisă, adăugarea de ATP reduce conductanța canalului, nu schimbă conductanța stării blocate cu tubulină. Concluzionăm că ATP electrostatic și, cel puțin parțial steric, este exclus din starea blocată de tubulină a VDAC.
2. Materiale și metode
A fost descrisă anterior procedura de reconstituire a VDAC în straturi bistrat lipidice [2, 15]. Straturile biliare s-au format din difitanil fosfatidilcolină (Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL). Dacă nu se specifică altfel, s-au utilizat soluții apoase 1 M de KCl tamponate cu 5 mM Hepes la pH 7,4. Potențialul este definit ca pozitiv atunci când este mai mare la partea adiției VDAC (partea cis). După introducerea canalelor VDAC, tubulina a fost adăugată pe ambele părți ale membranei sub agitare constantă timp de 2 minute. Consecutiv, poli (etilen glicol) de diferite greutăți moleculare (Sigma) au fost adăugați la concentrația finală de 15% (greutate/greutate). Soluția de ATP (Sigma) în KM 1 M și pH ajustat la 7,4 au fost introduse în compartimentele camerei prin perfuzie. Curenții au fost înregistrați și analizați conform descrierii anterioare [2] (a se vedea, de asemenea, Material suplimentar).
3. Rezultate si discutii
Efectul PEG a trei greutăți moleculare diferite asupra stărilor deschise și blocate de tubulină VDAC este prezentat în Figura 1. În prezența PEG 106 (Fig. 1A), conductanțele ambelor stări sunt reduse prin adăugarea polimerului. Acest lucru este legat de partiționarea polimerului în canalul porilor, care deplasează ionii și crește vâscozitatea soluției (Fig. 1, linii punctate Deschis și Deschis (PEG)). Conductanța stării blocate cu tubulină este, de asemenea, scăzută în mod semnificativ în prezența PEG 106, dar într-un grad mult mai mic de PEG 400 (Fig. 1A, B, linii punctate Blocate și Blocate (PEG)), sugerând că este prea îngust pentru ca moleculele PEG 400 să se împartă semnificativ. În cazul PEG 10000 (Fig. 1C), stările deschise și blocate cu tubulină arată o oarecare creștere a conductanței, ceea ce înseamnă că acest polimer este efectiv exclus din ambele stări ale canalului. De asemenea, este de remarcat faptul că PEG crește interacțiunea dintre tubulină și VDAC, ducând la evenimente de blocaj mai frecvente.