Reglarea metabolismului kinureninei printr-o dietă ketogenică
Svenja Heischmann
Departamentul de Științe Farmaceutice, Școala de Farmacie * Universitatea din Colorado Denver, Aurora, CO, 80045
Lindsey B. Gano
Departamentul de Științe Farmaceutice, Școala de Farmacie * Universitatea din Colorado Denver, Aurora, CO, 80045
Kevin Quinn
Departamentul de Științe Farmaceutice, Școala de Farmacie * Universitatea din Colorado Denver, Aurora, CO, 80045
Li-Ping Liang
Departamentul de Științe Farmaceutice, Școala de Farmacie * Universitatea din Colorado Denver, Aurora, CO, 80045
Jacek Klepacki
iC42 Cercetare și dezvoltare clinică, † Anschutz Medical Campus, Universitatea din Colorado Denver, Aurora, CO, 80045
Uwe creștini
iC42 Cercetare și dezvoltare clinică, † Anschutz Medical Campus, Universitatea din Colorado Denver, Aurora, CO, 80045
Nichole Reisdorph
Departamentul de Științe Farmaceutice, Școala de Farmacie * Universitatea din Colorado Denver, Aurora, CO, 80045
Manisha Patel
Departamentul de Științe Farmaceutice, Școala de Farmacie * Universitatea din Colorado Denver, Aurora, CO, 80045
Date asociate
Abstract
Dietele ketogenice (KD) sunt din ce în ce mai utilizate ca tratamente pentru epilepsie, alte boli neurologice și cancer. În ciuda istoriei lor îndelungate în suprimarea convulsiilor, mecanismele moleculare distincte de acțiune a KD sunt încă în mare parte necunoscute. Scopul acestui studiu a fost de a identifica metaboliții cheie și căile modificate în hipocampus și plasma șobolanilor hrăniți cu o dietă KD versus control (CD) fie ad libitum, fie restricționată caloric la 90% din aportul recomandat. Acest lucru a fost realizat folosind o combinație de metode vizate și analize metabolomice bazate pe MS nedestinate. Diferiți metaboliți ai căii de degradare a triptofanului (TRP), cum ar fi kinurenina (KYN), acidul cinurenic, precum și cofactorii enzimatici, au prezentat modificări semnificative între grupurile hrănite cu diete diferite și/sau cantități de calorii în plasmă și/sau hipocamp. KYN a fost semnificativ reglat în ambele matrice la animale din grupurile cu restricție calorică CD, KD-ad libitum și KD-restricționate caloric, comparativ cu grupul CD-ad libitum. Datele noastre sugerează că calea degradării TRP este o țintă cheie a KD.
Abordările metabolomice, adică evaluarea modificărilor moleculelor mici, pot sugera metaboliți specifici, grupuri de metaboliți și căi care sunt modificate într-un anumit cadru. Un metabolom specific, de exemplu din plasmă, țesut sau urină, poate reflecta modificările induse de boli, tratament sau genetică. Datorită copilăriei câmpului, datele metabolomice trebuie evaluate cu atenție nu numai prin instrumente software, ci și manual, pentru a se asigura că metaboliții cheie și căile metabolice afectate într-un cadru experimental sunt identificate cu acuratețe. Experimentele de urmărire folosind metode direcționate pot ajuta la asigurarea încrederii în identificare, completarea lacunelor și validarea ipotezelor. Din aceste motive, abordări specifice care îi ajută pe anchetatori să obțină o înțelegere mai detaliată a modulației căii sunt, în general, necesare în urma unor studii metabolomice mai puțin specifice. Prin urmare, acest studiu cuprinde o combinație de analize direcționate și nevizate, atât în plasmă, cât și în țesutul hipocampic, pentru a oferi o înțelegere cuprinzătoare a modului în care modificările modelului de molecule mici în plasmă și hipocampus se raportează la o KD.
Plasma reflectă în general schimbări sistemice; cu toate acestea, poate sugera modificări ale metaboliților și ale căilor metabolice în țesuturi specifice, de exemplu, anumite regiuni ale creierului în cazul tulburărilor neurologice/epileptice. Cu toate acestea, compartimentarea trebuie luată în considerare; de exemplu, nu orice compus traversează cu ușurință bariera hematoencefalică. În cazul multor epilepsii, o regiune a creierului cu un interes deosebit este hipocampul, deoarece se știe că aici apar numeroase modificări semnificative legate de boală (12-14). Scopul acestui studiu a fost de a elucida mecanismele prin care KD și restricția calorică își pot exercita efectele anti-convulsive și care modificări sunt induse de aceste regimuri în general. Profilarea metabolomică în plasmă și țesutul hipocampic al șobolanilor hrăniți cu KD sau dietă de control (CD) fie ad libitum (AL) sau restricționată caloric (CR) la 90% din aportul recomandat a sugerat modificări ale căii de degradare TRP/KYN. Modificările nivelurilor de metaboliți ai căii au fost investigate în continuare prin analize specifice; acestea au inclus HPLC-MS/MS și HPLC cuplate cu detecție electrochimică (ECD), dezvăluind modificări subtile ale căilor specifice, în principal în plasmă.
MATERIALE ȘI METODE
Studiu pe animale
Studiile pe animale au fost aprobate și monitorizate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Colorado Denver (Aurora, CO) și efectuate în conformitate cu liniile directoare aprobate. Cercetarea a fost concepută pe baza studiilor anterioare efectuate în laboratorul nostru și efectuate așa cum s-a descris anterior [CD-restricționat caloric (CCR), KD-restricționat caloric (KCR)] (12, 13). În plus, grupuri de animale cu acces nerestricționat la alimente au fost studiate pentru a obține informații detaliate despre efectele restricției calorice ușoare versus hrănirea AL a dietelor respective [CD-ad libitum (CAL), KD-ad libitum (KAL)]. Șobolanii Sprague Dawley masculi (P28 la începutul studiului) au fost hrăniți cu KD (# F3666; BioServ, Flemington, NJ) sau cu un CD (# F3517; BioServ) fie AL, fie restricționat caloriic la 90% din necesarul zilnic recomandat pentru o durată de 3 săptămâni (n = 6 per grup). Șobolanii au fost eutanasiați după 3 săptămâni prin decapitare sub anestezie cu CO2 și au fost colectate probe de țesut și plasmă.
pregătirea unei mostre
Analiza metabolomicii HPLC-MS.
O sută de microlitri de omogenat de plasmă sau țesut (1:10 țesut: apă cu 0,1% acetat de amoniu și 0,03% hidroxitoluen butilat) au fost utilizate pe probă pentru analiză, așa cum s-a descris anterior (15). Pe scurt, au fost adăugate standarde interne ca controale de calitate pentru extracția metabolitului, adică creatinină-d3, D-glucoză-13 C6, valină-d8, testosteron-d2, ceramidă C17, FA nesaturată C19: 1, acid heptadecenoic și cis-10 -acid nonadecenoic. S-a folosit o extracție lichid-lichid modificată în două etape a metil-terț-butil eterului pe baza metodei de extracție Bligh-Dyer pentru a extrage metaboliți și lipide apoase din probe de plasmă și țesut.