Obezitatea crește inflamația și afectează funcția limfatică la un model de limfedem la șoarece

Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: B. J. Mehrara, Weill Cornell Univ. Medical Center, 1275 York Ave., Suite MRI 1006, New York, New York 10065 (e-mail: [email protected]).

Abstract

În studiul de față, am analizat efectele obezității induse de dietă (DIO) asupra fiziologiei limfatice și a dezvoltării limfedemului utilizând un model de șoarece. Aici, arătăm că șoarecii adulți masculi C57BL/6J hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi devin obezi și dezvoltă o capacitate de transport a lichidului limfatic redus la momentul inițial, comparativ cu colegii slabi care au hrană cu o dietă normală de chow. Mai important, arătăm că șoarecii obezi au un fenotip de limfedem de coadă mai sever cu depunere crescută de adipos, fibroză și inflamație. În mod interesant, folosind un model de iritare topică, am constatat că șoarecii obezi au o înclinație semnificativ crescută la inflamația țesuturilor în comparație cu șoarecii slabi, cu infiltrare marcat crescută de macrofage și neutrofile. Luate împreună, rezultatele noastre sugerează că obezitatea scade funcția limfatică și crește tendința de inflamație la momentul inițial și că aceste efecte sunt amplificate de leziuni limfatice, ducând la un fenotip de limfedem mai sever.

Toate protocoalele experimentale au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Șoarecii masculi C57BL/6J au fost cumpărați de la Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) și întreținuți într-un mediu controlat de temperatură și lumină. Pentru a stabili DIO, șoarecii masculi adulți au fost menținuți pe o dietă bogată în grăsimi (60% kcal din grăsimi, W.F Fisher & Son) începând cu vârsta de 6 săptămâni ad libitum timp de 8-10 săptămâni. Șoarecii masculi de tip sălbatic martor, în funcție de vârstă, au fost menținuți pe o dietă normală (13% kcal din grăsimi; Purina PicoLab Rodent Diet 20, W.F Fisher & Son) pentru aceeași perioadă de timp (19, 29). La încheierea experimentului, animalele au fost cântărite cu ajutorul unei cântare digitale (Sartorius, Bradford, MA).

Modelul limfedemului de coadă de șoarece.

Animalele cu control obez și slab au suferit leziuni limfatice utilizând un model de limfedem bine descris de coadă de șoarece, în care sistemul limfatic superficial și profund al cozii a fost excizat printr-o excizie circumferențială a pielii de 2 mm în mijlocul porțiunii cozii (5, 9, 23, 26). Grupul nostru și alții au arătat anterior că acest model are ca rezultat limfedemul susținut al cozii distale, afectarea severă a funcției limfatice și caracteristicile histologice ale limfedemului clinic (de exemplu, inflamație cronică, depunere adipoasă și fibroză) timp de cel puțin 10 săptămâni postoperator ( 5, 9, 23, 26). Un set separat de animale obeze și slabe ( = 8-10 animale/grup) nu au avut intervenții chirurgicale pe coadă și au servit drept controale de bază. Animalele au fost eutanasiate 6 săptămâni postoperator și analizate așa cum este prezentat mai jos.

Volumele cozii, limfoscintigrafia și analiza histologică.

Calculele volumului cozii au fost analizate utilizând măsurători multiple ale circumferinței cozii digitale distale față de zona de leziune limfatică și formula conului trunchiat, așa cum s-a descris anterior (9). Limfoscintigrafia a fost, de asemenea, efectuată așa cum a fost descris anterior pentru a cuantifica fluxul limfatic către ganglionii limfatici sacri prin injectarea a 50 μl de tehnetiu filtrat (99 m Tc) coloid de sulf în coada distală (6). Absorbția ajustată la decădere a fost înregistrată în ganglionii limfatici sacri utilizând o cameră X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA), iar analiza regiunii de interes a fost efectuată utilizând software-ul ASIPro (CTI Molecular Imaging, Knoxville, TN) (9).

Pentru analiza histologică și imunohistochimică, secțiunile de coadă au fost recoltate, fixate scurt în paraformaldehidă răcită cu gheață 4% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), decalcificate folosind EDTA 5% (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) timp de 72 de ore, și parafină încorporată. Secțiunile abdominale au fost recoltate de la șoareci obezi și martori, folosind truse de biopsie de 5 mm (Fray Products, Buffalo, NY), fixate în paraformaldehidă de 4% (Affymetrix, Cleveland, OH) și ulterior încorporate parafină. Secțiunile colorate cu hematoxilină și eozină au fost preparate utilizând tehnici standard, iar analiza grosimii țesutului subcutanat a fost efectuată în secțiuni transversale histologice situate la 1,5 cm distanță de locul chirurgical de către examinatorii orbi ( = 6-8 secțiuni/grup). Distanța de la stratul bazal al epidermei la fascia profundă a fost analizată în 4 regiuni/secțiune standardizate.

Colorarea imunohistochimică a fost efectuată în conformitate cu tehnicile noastre stabilite (5). Țesuturile încorporate în parafină au fost rehidratate pe scurt și demascarea antigenului a fost efectuată folosind citrat de sodiu în fierbere (Sigma-Aldrich). Activitatea peroxidazei endogene a fost stinsă, iar legarea nespecifică a fost blocată cu 2% BSA-20% ser animal. Țesuturile au fost incubate cu anticorp primar peste noapte la 4 ° C și colorarea anticorpului a fost vizualizată utilizând anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean, dezvoltați cu complex diaminobenzaminic (Vector, Burlingame, CA). Anticorpii primari utilizați pentru petele imunohistochimice au inclus receptorul hialuronan endotelial al vasului limfatic (LYVE) -1, CD45 și CD4 (toți din R&D, Minneapolis, MN). Toți anticorpii secundari au fost obținuți din Vector Laboratories. Secțiunile au fost analizate folosind microscopie cu câmp luminos, iar regiunile de interes au fost scanate folosind un scaner cu diapozitive Mirax (Zeiss, München, Germania). Numărul de celule a fost efectuat pe secțiuni de mare putere, cu un minim de 4-6 animale/grup și 4-5 câmpuri de mare putere (HPF)/animal de către doi recenzori orbi.

Fibroza a fost evaluată folosind metodele noastre publicate anterior pentru a cuantifica colorarea roșie Sirius (Polysciences, Warrington, PA) și imunohistochimia de tip I a colagenului (4). Pe scurt, indicele cicatricial roșu Sirius a fost calculat utilizând microscopie cu lumină polarizată pentru a determina raportul birrefringenței portocaliu/roșu/galben/verde și a fost analizat utilizând software-ul Metamorph Offline. Imunohistochimia colagenului de tip I a fost efectuată utilizând un anticorp împotriva colagenului de șoarece de tip I (Abcam, Cambridge, MA) și cuantificată ca raport dintre aria dermei colorate pozitiv într-un prag fix și aria țesutului.