O procedură de economisire pentru a elimina tamponul de grăsime mamară de șoarece de componentele epiteliale pentru transplant
Informații despre articol
Abstract
rezumat
Transplantul de celule epiteliale în tampoane de grăsime curățate este o tehnică larg utilizată în studiul biologiei glandelor mamare. A fost descris pentru prima dată în 1959 și a rămas o tehnică valoroasă, cel mai recent coroborat cu analiza anlagenului mamar de la șoareci knockout cu fenotip letal embrionar sau defect de reproducere, precum și pentru testele de celule stem epiteliale mamare sau analiza celulelor precanceroase. Glandele mamare, spre deosebire de majoritatea celorlalte organe, se dezvoltă în principal postnatal. Când cantitatea mică de epiteliu endogen prezent în tamponul de grăsime al unui șoarece prepubertal este îndepărtată, acest clearance lasă un mic mediu natural care poate fi repopulat cu celule epiteliale furnizate exogen. Celulele cu potențial de dezvoltare adecvat (celule stem sau celule progenitoare) pot regenera porțiunea epitelială a glandei mamare după pubertate și sarcină. Clearance-ul convențional al tamponului de grăsime este o procedură chirurgicală implicată. Am îmbunătățit tehnica și am minimizat operația și timpul de recuperare, menținând în același timp o îndepărtare eficientă a epiteliului endogen din tamponul de grăsime mamară.
Transplantul de celule în tampoane de grăsime eliminate de la șoarece este adesea utilizat pentru a studia comportamentul celulelor stem epiteliale mamare sau pentru a analiza efectele modificărilor genetice asupra creșterii, diferențierii și apoptozei glandei mamare. Structura ușor accesibilă a glandei mamare și faptul că glanda nu este un organ vital fac posibile aceste experimente. Tehnica a fost descrisă pentru prima dată de DeOme și colab. (1959). Cursul experimental necesită îndepărtarea epiteliului endogen din tamponul de grăsime al șoarecilor tineri; fragmentele de țesut sau suspensiile celulare pot fi apoi introduse în tamponul de grăsime curățat. Aceste celule transplantate pot crește și se diferențiază și formează un arbore ductal aproape indistinct de cel endogen.
Deși tehnica de curățare și transplant a glandei mamare a fost dezvoltată la sfârșitul anilor 1950, este încă foarte util să răspundem la multe dintre întrebările experimentale moderne. Transplantul de celule în tamponul de grăsime și analiza consecventă a structurilor rezultate au fost utilizate pentru a evalua proprietățile celulelor stem și capacitatea lor de regenerare (a se vedea Smith & Boulanger 2003, Visvader 2006 și pentru referințe la acestea). Celulele care au fost modificate de infecțiile retrovirale au fost analizate pentru a evalua consecințele expresiei oncogenei asupra glandei mamare (Edwards 2000) și au oferit informații despre tumorigeneză mamară (Daniel și colab. 1968, Medina 1976, Edwards și colab. 1996).
Transplantul de fragmente de țesut mamar de la șoareci transgenici sau knockout în tampoane de grăsime curățate de șoareci de tip sălbatic a fost utilizat atunci când manipularea genetică a dus la un fenotip animal steril sau letal embrionar. Mediul tamponului de grăsime de la șoareci de tip sălbatic oferă condiții normale de dezvoltare și, astfel, se pot distinge efectele fenotipice care rezultă din modificări genetice în compartimentele epiteliale sau stromale (Klinowska & Streuli 2000, Parmar & Cunha 2004).
Celulele mamare precanceroase de șoarece pot fi menținute și progresia lor canceroasă poate fi observată în tamponul de grăsime eliminat (Cardiff și colab. 2006). De asemenea, este posibil să se umanizeze tamponul de grăsime pentru a sprijini creșterea celulelor epiteliale ale sânului uman normal și canceros (Kuperwasser și colab. 2004, Liu și colab. 2006).
Șoarecii au 10 glande mamare, câte cinci pe fiecare parte, situate ventro-lateral. Se pot distinge ca glandele toracice, numerele 1-3, și glandele inghinale, numerele 4 și 5. Glanda inghinală numărul 4 este cel mai ușor accesibilă și, prin urmare, este utilizată în mod obișnuit pentru experimentele de compensare și transplant.
La nivelul embrionului de șoarec în curs de dezvoltare se poate observa o mică anlagie a glandei mamare. Arborele glandular crește în timpul pubertății și diferențierea funcțională apare în glanda adultă în timpul sarcinii și alăptării. Proliferarea celulelor epiteliale și extinderea canalelor epiteliale umple tamponul în timpul pubertății. Mugurii terminali terminali sunt esențiali pentru extinderea conductelor în timpul pubertății. La sarcină, sunt specificate celulele alveolare, care se diferențiază în celule secretoare care sintetizează proteinele din lapte. După ce încetează alăptarea, glanda mamară suferă moarte și remodelare celulară programată, cunoscută sub numele de involuție, revenind la o stare comparabilă cu glanda virgină (Hovey & Trott 2004).
Înainte ca celulele să poată fi transplantate, este necesară îndepărtarea completă a țesutului epitelial endogen din tampon. Acest lucru este practic cel mai fezabil în primele trei săptămâni după naștere. În acest timp, structura ductală este limitată la proximitatea mamelonului. După pubertate, canalele se extind până la marginile tamponului de grăsime mamară și nu pot fi îndepărtate complet fără a distruge tamponul de grăsime. După îndepărtarea celulelor epiteliale, tamponul de grăsime mamară rămas este un mic mediu favorabil proliferării și diferențierii epiteliale. Dacă celulele epiteliale rămân după eliminare, ele pot crește împreună cu celulele transplantate și pot complica interpretarea analizei histologice.
Metoda chirurgicală actuală implică îndepărtarea anlagei folosind un microscop de disecție (Figurile 1a - c). Pielea abdominală este deschisă de o mare Da-incizie în formă. Anlajul glandei mamare este extras cu partea din tamponul de grăsime cea mai apropiată de mamelon. Vasele de sânge nutritive și zona mamelonului sunt cauterizate, precum și conexiunea cu a cincea glandă inghinală, iar rana este închisă. Celulele ductale imediat sub mamelon rămân și pot contamina transplantul, dacă mamelonul este lăsat în piele. Incizia are o lungime de câțiva centimetri și o cantitate mare de țesut este deconectat de la corp.
Figura 1 Compararea metodelor vechi și noi de eliminare a tamponului de grăsime mamară. Metoda veche: (a) Linii de incizie pentru metoda clasică de a curăța fadul de grăsime mamară. (b) După incizie, pielea este pliată înapoi pentru a expune întreaga glandă mamară. Aceeași procedură s-ar repeta și pe partea contralaterală. (c) Rana este închisă folosind șase cleme Michel. Nouă metodă: (d) cercurile din jurul mamelonului marchează incizia pentru a rezeca anlajul mamar. (e) Pielea din jurul mamelonului este excizată și mamelonul și doar o parte din tamponul de grăsime mamară este expus. (f) Rana este închisă folosind două cleme Michel
Am modificat procedura pentru a minimiza rana în urma intervenției chirurgicale și, în același timp, a obținut o rată de succes ridicată pentru eliminarea grăsimii. Vă prezentăm o variantă a metodei originale descrisă de DeOme și colab. (1959), care poate fi considerat mai puțin dăunător pentru animale și o îmbunătățire a tehnicii.
Materiale și metode
Animale
Șoareci femele C57BL/6NCrl, BALB/cAnNCrl (Charles River, Sulzfeld, Germania) și șoareci transgenici cu proteină fluorescentă verde îmbunătățită (EGFP) (C57BL/6Tg (ACTB-EGFP) Osb, Jackson Labs, Bar Habor, ME, SUA) au fost adăpostiți în conformitate cu legile germane privind bunăstarea animalelor și cu liniile directoare pentru adăpostirea animalelor de la Federația Asociațiilor Europene de Științe a Animalelor de Laborator (FELASA). Au fost date hrană și apă ad libitum. Animalele erau ținute în cuști deschise sau cuști ventilate individual. Experimentele pe animale au fost examinate de către comitetul pentru bunăstarea animalelor din Regierungspräsidium Darmstadt.