O abordare multi-serotip clarifică regulonul proteinei A de control al catabolitului la omul major

Subiecte

Abstract

Proteina de control a catabolitului A (CcpA) este un regulator principal conservat, care utilizează sursa de carbon în bacteriile gram-pozitive, dar regulonul CcpA rămâne prost definit. În acest studiu ne-am propus să clarificăm regulonul CcpA prin determinarea impactului inactivării CcpA asupra virulenței și transcriptomului a trei serotipuri distincte ale principalului patogen uman Grup A streptococ (GAZ). Inactivarea CcpA a scăzut semnificativ virulența GAS într-o gamă largă de modele de provocare animală, în concordanță cu ideea că CcpA este esențială pentru patogeneza bacteriană gram-pozitivă. Prin transcriptomică comparativă, am stabilit că regulonul central al GAS CcpA este îmbogățit pentru motive de legare CcpA foarte conservate (adică. cre site-uri). Dimpotrivă, diferențele specifice tulpinii în transcriptomul CcpA par să constea în principal din rețele secundare afectate. Rafinarea cre compoziția site-ului prin analiza regulonului de bază a facilitat dezvoltarea unui modificat cre consens care arată promisiune pentru o predicție îmbunătățită a țintelor CcpA la alți agenți patogeni gram-pozitivi relevanți din punct de vedere medical.

Introducere

Mai multe studii au demonstrat o legătură între CcpA și virulența agenților patogeni gram-pozitivi majori, cum ar fi Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Staphylococccus aureus, Clostridium difficile, Bacillus anthracis și Enterococcus faecium 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Având în vedere povara imensă a infecțiilor bacteriene gram-pozitive, CcpA este una dintre cele mai influente proteine ​​reglatoare care modulează peisajul de virulență al bacteriilor patogene 26. În ciuda faptului că a fost investigat extensiv de peste 20 de ani, rămân numeroase lacune de cunoștințe critice în ceea ce privește funcția CcpA și impactul acesteia asupra patogeniei bacteriene. De exemplu, deși se știe că CcpA afectează expresia lui

15% din genomii a numeroase specii bacteriene, contribuția directă vs. efectele indirecte mediate de CcpA asupra transcrierii rămân neclare 15,27. În mod similar, rolul CcpA în virulența bacteriană gram-pozitivă a fost studiat în principal în modele de bacteremie, care reprezintă doar o fracțiune din tipurile de infecții pe care bacteriile care conțin CcpA le provoacă 28. Sunt necesare informații suplimentare cu privire la contribuția CcpA la patogeneza bacteriană gram-pozitivă, având în vedere rolul potențial al axei CcpA- (HPr-Ser46-P) -HPrK/P ca țintă antimicrobiană nouă 29 .

Majoritatea cunoștințelor referitoare la efectele mediate de CcpA asupra expresiei genetice s-au produs în avirulent Bacillus subtilis care este în legătură îndepărtată cu majoritatea organismelor în care s-a stabilit un rol pentru CcpA în patogenie 16,21,30,31. În schimb, grupa A. streptococ (GAS) cauzează o gamă largă de infecții la om pentru care sunt stabilite modele animale 32, este redusă mai puțin virulentă prin inactivarea CcpA și este strâns legată de alte organisme a căror infectivitate este afectată de ștergerea CcpA, cum ar fi S. pneumoniae și Streptococcus suis 15.18. Astfel, GAS poate fi utilizat pentru a evalua natura impactului de reglementare al CcpA asupra infectivității agenților patogeni gram-pozitivi. Am stabilit anterior că inactivarea CcpA într-o tulpină serotip M1 GAS afectează expresia

15% din genom și reduce letalitatea într-un model de infecție cu bacteremie. Există> 140 de serotipuri M distincte de GAS și inactivarea unei proteine ​​reglatoare poate avea efecte dramatic diferite în funcție de serotipul GAS studiat 33,34. Astfel, am căutat să studiem inactivarea CcpA în serotipuri multiple GAS pentru a testa ipotezele că efectul inactivării CcpA asupra virulenței GAS nu este dependent de serotip și că transcriptomica comparativă a tulpinilor GAS lipsite de CcpA ar facilita identificarea nucleului GC CcpA regulon.

Rezultate si discutii

CcpA ștergerea are efecte specifice serotipului

Pentru a îmbunătăți înțelegerea contribuției CcpA la fiziopatologia largă a infecțiilor cu GAS, am căutat să analizăm funcția CcpA la tulpinile de serotip M care sunt principalele cauze ale infecțiilor cu GAS și care sunt legate la distanță pe baza filogeniei genomului întreg (Fig. 1a) 35, 36,37,38. De asemenea, am folosit tulpini parentale care sunt complet secvențiate și se știe că nu au mutații în sistemul de control al virulenței (CovRS) cu două componente care afectează transcriptomul CcpA deoarece CovR și CcpA co-reglează numeroase gene GAS 39. Astfel, am ales tulpinile MGAS2221 (M1), MGAS10870 (M3) și MGAS6180 (M28) pentru studiul nostru 36,37,38. Secvența proteinei CcpA din aceste trei tulpini este identică (datele nu sunt prezentate). Inactivarea CcpA în aceste trei medii a dus la un defect de creștere substanțial în mediu bogat numai pentru tulpina serotip M3 MGAS10870 (Fig. 1b). Deși de ce doar MGAS10870ΔccpA tulpina arată că un defect de creștere nu este cunoscut, important, acest defect de creștere este recuperat în ccpA-tulpină completată (Fig. 1b) atribuind absența ccpA ca cauză principală a defectului de creștere. În concordanță cu observațiile anterioare pentru tulpinile serotipului M1, inactivarea CcpA a redus dimensiunea coloniei în tulpina MGAS10870 16,39. În schimb, coloniile MGAS6180 erau uniform mici și neafectate de pierderea ccpA (Fig. Suplimentar S1).

abordare

Caracterizarea tulpinilor serotipice GAS M și a acestora ccpA derivate.

(A) Filogenia genomului întreg al tulpinilor GAS secvențiate. Genomurile GAS complete ale serotipurilor M indicate (albastru) au fost obținute de la NCBI. Relațiile au fost deduse din 68.084 nuclei polimorfism nucleotidic (SNP) loci folosind SplitsTree. Localizarea tulpinilor parentale utilizate în această lucrare sunt prezentate în roșu. () Curbele de creștere pentru tipul sălbatic, ccpA-tulpini inactivate și completate în THY. Punctele de date sunt deviații medii și standard de la probele duplicate ale fiecărei tulpini măsurate în două ocazii independente.

CcpA afectează virulența GAS în mai multe modele de infecție

Efectul ccpA deleția asupra virulenței tulpinilor de serotip GAS la modelele de infecție la șoareci.

Șoarecii elvețieni CD-1 au fost inoculați cu tulpini GAS prin intraperitoneal (A) sau intranazal () traseu. Șoarecii au fost monitorizați până la aproape mortalitate pentru modelul de bacteremie (A) și supraviețuirea a fost reprezentată grafic. Pentru modelul orofaringian (), tampoane de gât au fost obținute zilnic și densitatea bacteriană a fost reprezentată grafic. Valorile P au fost derivate din analiza măsurilor repetate (vezi Metode).