Localizarea, identificarea și excizia depozitelor de adipos murin
Adrien Mann
1 Departamentul de Medicină de Urgență, Universitatea din Cincinnati College of Medicine
Allie Thompson
1 Departamentul de Medicină de Urgență, Universitatea din Cincinnati College of Medicine
Nathan Robbins
1 Departamentul de Medicină de Urgență, Universitatea din Cincinnati College of Medicine
Andra L. Blomkalns
1 Departamentul de Medicină de Urgență, Universitatea din Cincinnati College of Medicine
Abstract
Introducere
Adiposul a făcut o apariție notabilă în lumina reflectoarelor media, datorită creșterii dramatice a obezității în ultimele decenii ale secolului XX. Obezitatea afectează în prezent mai mult de o treime din adulți și 17% din copii și adolescenți din Statele Unite (SUA) 1. În toate grupurile etnice, cercetările statistice din jurul epidemiei de obezitate au arătat că negrii non-hispanici au cea mai mare rată de obezitate ajustată în funcție de vârstă (49,5%), comparativ cu mexicanii americani (40,4%), toți hispanicii (39,1%) și cei non-hispanici. Albii hispanici (34,3%) 2. Efectul economic al obezității este, de asemenea, o preocupare tot mai mare pentru sistemul de sănătate. În 2012, s-a estimat că costul medical anual al îngrijirii obezității în SUA în 2005 a fost de 190,2 miliarde de dolari, aproape 21% din bugetul total al cheltuielilor medicale. Din păcate, obezitatea infantilă a fost estimată a fi responsabilă doar de 14 miliarde de dolari în costuri medicale directe. Statistic, s-a stabilit că costul medical mediu al persoanelor cu obezitate a fost de 2.741 dolari mai mare pe an decât cei fără această morbiditate 3-5 .
Obezitatea este un factor de risc major pentru o varietate de afecțiuni, cum ar fi: diabetul de tip 2, dislipidemia, bolile cardiovasculare, cancerul, tulburările scheletice musculare și inflamația cronică. Obezitatea este profund legată de patogeneza sindromului metabolic și a altor boli cronice 6-8. Cu legături atât de drastice și negative între obezitate și alte comorbidități, cercetările științifice au concentrat atenția pentru a înțelege mai bine epidemia actuală și rolurile diverse și pivot jucate de adipos.
Din punct de vedere istoric, țesutul adipos a fost considerat lipsit de consecințe și a fost privit doar ca un simplu țesut de umplere. În prezent, s-a demonstrat că adiposul joacă multe roluri esențiale în funcția corpului în: metabolism, reglarea hormonilor, inflamație, protecție și izolare 9. Țesutul adipos este compus în principal din adipocite, dar conține, de asemenea, pericite, celule endoteliale, monocite, macrofage și celule stem pluripotente 8. Țesutul adipos este distribuit pe tot corpul în depozite distincte. Principalele depozite pot fi găsite subdermic, subcutanat, intramuscular și visceral 10. S-a arătat că depozitele adipoase au profiluri metabolice specifice depozitului, care au demonstrat o sensibilitate specifică depozitului la obezitate și tulburări conexe 8 .
În mod tradițional, țesutul adipos a fost clasificat în două tipuri majore: țesutul adipos alb (WAT) și țesutul adipos maro (BAT); deși literatura recentă indică prezențele unui al treilea grup botezat brite sau bej adipos 11. S-a demonstrat că țesutul adipos are diferite culori, morfologii, funcții metabolice, caracteristici biochimice și modele genetice de exprimare 10. Adipocitele din WAT au o picătură lipidică simplă și mare și cantități variabile de mitocondrii. WAT se găsește în mod predominant în localitățile subcutanate și viscerale ale corpului. WAT funcționează în primul rând ca un loc de stocare a energiei și protecție a organelor. Adipocitele din BAT au o morfologie multiloculară și mitocondrii abundente. BAT este localizată în principal în gât și în vasele mari de sânge ale toracelui, precum și în scapule 12. BAT funcționează în principal în comportamente care consumă energie care reglează termogeneza 7. S-a dovedit că adipozele brite sau bej împărtășesc o morfologie și o expresie similare BAT, dar s-a constatat că provine din adipocite albe 11 .
Scopul acestui protocol este de a oferi o metodă precisă pentru identificarea și izolarea diferitelor tipuri de depozite de grăsime din locații anatomice multiple.
Protocol
NOTĂ: Toate procedurile la animale au fost efectuate cu aprobarea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității din Cincinnati și în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator de la Institutul Național de Sănătate (Publicația NIH nr. 85-23, revizuit 1996).
1. Eutanasiați și sterilizați mouse-ul
Așezați mouse-ul într-o cutie care conține o doză suprateraputică de izofluran și lăsați să inspire să efectueze. Odată ce mouse-ul este eutanasiat, scoateți din cutie.
Dislocarea cervicală ca al doilea mijloc de eutanasie.
Sterilizați suprafața exterioară a șoarecelui prin curățarea animalului cu 70% etanol.
2. Identificarea și izolarea a trei depozite adipoase diferite
Izolarea țesutului adipos maro (BAT):
Asigurați-vă că blana este umedă de curățarea alcoolului pentru a ajuta la tăierea straturilor epidermice și dermice.
Poziționați mouse-ul într-o poziție culcat pe spate cu masa.
Apucați pielea chiar sub diafragmă cu forceps, ridicați și incizați cu foarfeca.
Tăiați transversal în jurul circumferinței mouse-ului pentru a expune peritoneul.
Descoperiți depozitul BAT în formă de fluture prin degloving jumătatea superioară a mouse-ului. Țineți apendicele inferioare și abdomenul într-o mână și trageți pielea în sus spre cap.
Orientează mouse-ul, astfel încât să fie poziționat înclinat pe masă. Aveți grijă să nu contaminați depozitul expus cu păr.
Curățați instrumentele chirurgicale și schimbați-le cu o pereche proaspătă de mănuși.
Localizați scapulele și depozitul corespunzător. Îndepărtați cu grijă orice adipos alb superficial de deasupra fluturelui și apoi disecați fluturele de grăsime maro intercapulară. Aveți grijă să evitați mușchiul strâns asociat cu grăsimea brună. NOTĂ: Se recomandă utilizarea unui microscop de disecție pentru îndepărtarea adiposului alb, precum și pentru separarea adiposului maro de scapule.
Îndepărtați depozitul de grăsime și transferați într-un tub de microcentrifugă de 2 ml.
Dacă ARN-ul sau proteina urmează să fie extrase, înghețați țesutul prin imersiune în azot lichid și depozitați la -80 ° C. Congelați proba imediat pentru a preveni degradarea. Dacă cultivați, acoperiți țesutul în DMEF-12 și puneți-l pe gheață până când toate probele sunt colectate pentru cultură (informații suplimentare).
Izolarea țesutului adipos subcutanat (SQ), un depozit de țesut adipos alb (WAT):
Puneți o pereche proaspătă de mănuși pentru a nu se contamina încrucișat între depozitele de grăsimi.
Descoperiți depozitele SQ inghinale, triunghiulare, scoțând din mănușă jumătatea inferioară a mouse-ului. Țineți apendicele superioare și toracele într-o mână și trageți pielea în jos spre picioare cu cealaltă mână.
Orientați mouse-ul în poziție culcat în timp ce aveți grijă să nu contaminați depozitul expus cu păr.
Curățați instrumentele chirurgicale și schimbați-le cu o pereche proaspătă de mănuși.
Disecați cu atenție triunghiurile grăsimii SQ. Aveți grijă să nu contaminați proba cu mușchi, grăsimi învecinate, glande mamare sau prin tăierea oricăror vase și contaminați proba cu sânge. NOTĂ: Se recomandă utilizarea unui microscop de disecție dacă marginile nu sunt clar definite.
Îndepărtați depozitele de grăsime și transferați-le în tuburile de microcentrifugă de 2 ml.
Dacă ARN-ul sau proteina urmează să fie extrase, înghețați țesutul prin imersiune în azot lichid și depozitați la -80 ° C. Congelați proba imediat pentru a preveni degradarea.
Pentru colorare, fixare sau încorporare în OCT. Dacă cultivați, acoperiți țesutul în DMEF-12 și puneți-l pe gheață până când toate probele sunt colectate pentru cultură (informații suplimentare).
Izolarea grăsimii gonadale a unui țesut adipos visceral (TVA) și a depozitului de țesut adipos alb (WAT):