Livrarea orală de ARN-uri dublu catenare induce mortalitatea la nimfe și adulți ai citricelor asiatice

Afilieri Laboratório de Biotecnologia, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, Instituto Agronômico de Campinas, Cordeirópolis, São Paulo, Brazilia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazilia

dublu

Afiliere Laboratório de Biotecnologia, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, Instituto Agronômico de Campinas, Cordeirópolis, São Paulo, Brazilia

Afiliere Escola Superior de Agricultură Luiz de Queiróz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, São Paulo, Brazilia

Departamentul de patologie a plantelor de afiliere, Universitatea din California Davis, Davis, California, Statele Unite ale Americii

Afiliere Laboratório de Biotecnologia, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, Instituto Agronômico de Campinas, Cordeirópolis, São Paulo, Brazilia

  • Diogo Manzano Galdeano,
  • Michèle Claire Breton,
  • João Roberto Spotti Lopes,
  • Bryce W. Falk,
  • Marcos Antonio Machado

Cifre

Abstract

Citare: Galdeano DM, Breton MC, Lopes JRS, Falk BW, Machado MA (2017) Livrarea orală a ARN-urilor dublu catenare induce mortalitatea la nimfe și adulți ai psilidei citrice asiatice, Diaphorina citri. PLOS ONE 12 (3): e0171847. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171847

Editor: Randall P. Niedz, Departamentul Agriculturii din Statele Unite, STATELE UNITE

Primit: 1 august 2016; Admis: 26 ianuarie 2017; Publicat: 10 martie 2017

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de Fundația Amparo din Pesquisa do São Paulo (2013/02138-0, 2014/03925-8 și 2008/57909-2) și CNPq (573848/08-4).

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Psilida asiatică a citricelor (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), este o insectă hrănitoare cu floem și cel mai important dăunător din punct de vedere economic al citricelor, în principal pentru că este vectorul pentru agenții cauzali ai huanglongbing (HLB), Candidatus Liberibacter asiaticus și Candidatus Liberibacter americanus [1,2]. HLB apare în toate regiunile de citrice din Asia, Africa și America și este cea mai importantă boală care afectează citricele la nivel mondial, având ca rezultat declinul copacilor, calitatea redusă a fructelor și moartea copacilor [3-5]. Atât adulții ACP, cât și nimfele pot transmite bacteriile, iar atunci când este dobândită de nimfe, bacteriile pot fi reținute și transmise după apariția adulților, sugerând că agentul patogen se înmulțește și circulă în ACP [6]. Mai mult, bacteriile pot fi transmise la rate scăzute de la femelele infectate transovarial la descendenții lor [7] și de la masculii infectați la femelele neinfectate în timpul împerecherii [8].

Pentru a controla populațiile de D. citri, cultivatorii de citrice utilizează mai multe insecticide diferite [9]. Cu toate acestea, utilizarea nediscriminată și continuă a acestor insecticide poate duce la rezistența dăunătorilor, ceea ce duce invariabil la creșterea costurilor de producție [10]. O provocare principală pentru cercetători a fost dezvoltarea de strategii eficiente pentru controlul D. citri cu impact redus asupra mediului, cum ar fi utilizarea ectoparasitoidului Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae) [11] ca prădător natural [12], ciuperci entomopatogene [13] ] și recent interferența ARN (ARNi) [14-16].

ARNi este un instrument puternic pentru studierea genomicii funcționale la eucariote, inclusiv la insecte [17]. Descoperirea ARN-ului cu dublă catenă (dsRNA) mediate de tăcere specifică genei în nematodul Caenorhabditis elegans [18] a permis ca ARN-urile mediate de dsARN să fie utilizate pentru diferite insecte de cultură pentru a reduce la tăcere anumite gene [19].

Primul pas pentru succesul ARN-ului la insecte este acela de a identifica o metodă convenabilă și fiabilă pentru administrarea ARNd-ului către gena țintă. Microinjecția, înmuierea și hrănirea sunt de obicei adoptate pentru a furniza ARNd-ul către insecte [20]. Au fost raportate efecte de eliminare a ARNm țintă de succes prin hrănirea artificială a ARNds la insectele dăunătoare ale culturilor, inclusiv psyllidul de cartofi/roșii (Bactericera cockerelli), muștele alb (Bemisia tabaci), viermele rădăcinii de porumb occidental (Diabrotica virgifera virgifera), afidul de mazăre (Acyrthosiphon pisum), viermele de bumbac (Helicoverpa armigera), musca orientală a fructelor (Bactrocera dorsalis), viermele de sfeclă (Spodoptera exigua) și pădărul brun (Nilaparvata lugens) [21-29]. Cu toate acestea, este dificil să se utilizeze hrănirea artificială a ARNd-ului în timpul etapelor juvenile ale unor insecte; astfel, a fost dezvoltat un sistem eficient pentru a reduce la tăcere genele nimfelor cu muște albe prin hrănirea dsRNA mediată de frunze [30]. Mai mult, unele studii au demonstrat că ineficiența administrării orale de ARNi în rândul speciilor de insecte este atribuibilă degradării rapide a ARNd-ului, care este probabil indusă de enzimele nucleaze în lumenul intestinal [31,32] sau în salivă [33], astfel, pentru aceste specii de insecte, metoda de livrare mai bună a ARNd-ului este injectarea de ADNr gol în cavitatea corpului [34].

În studiul de față, am explorat efectele ARNi la adultul și nimfa D. citri care au fost hrănite cu ADNr specifice genei care vizează catepsina D, chitina sintază și inhibitorul apoptozei printr-o dietă artificială și prin frunze de plante. Am arătat că ambele metode de eliberare a ARNd sunt eficiente în reducerea genelor ACP, reducând rata mortalității în timp și reglând în jos genele țintă.

Materiale și metode

Insecte și plante

ACP-urile au fost crescute în Citrus macrophylla în cuști de plasă menținute la 25 ± 2 ° C sub o fotoperioadă de 14:10 h (lumină: întuneric) și 60 până la 70% umiditate relativă (HR) la Facilitatea de Cercetare Conținută (CRF) a Universității din California, Davis (CA, SUA; http://crf.ucdavis.edu/). ACP-urile generale adulte și femelele împerecheate au fost utilizate pentru testele de hrănire a dietei artificiale și respectiv în pliantele Murraya paniculata (L) Jack (Rutaceae).

Izolarea ARN și sinteza ADNc

ARN-urile totale au fost izolate dintr-un grup de zece ACP vii folosind ZR Tissue and Insect Microprep ™ (Zymo Research, Irvine, CA, SUA, catalog nr. D6015), iar ADN-ul genomic a fost îndepărtat din probe cu un set DNAse I (Zymo Research, Irvine, CA, SUA, catalog nr. E1010) conform protocolului producătorului. Concentrația și puritatea au fost determinate folosind un spectrofotometru NanoDrop ND 8000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, SUA). Sinteza ADNc a fost efectuată utilizând iScript ™ Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad ®, Hercules, CA, SUA, catalog nr. 170–8841) conform protocolului producătorului.

Identificare, exemplu de proiectare și amplificare a genelor țintă

Pentru a identifica catepsina D, chitina sintază și inhibitorul genelor apoptozei ACP, adnotarea secvențelor transcriptomului D. citri a fost efectuată prin screening-ul băncii de date Psyllid.org (http://psyllid.org/download) pe baza secvențelor de aminoacizi. de insecte depuse în NCBI (Acyrthosiphon pisum, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Apis florea, Apis mellifera, Bombus impatiens, Bombus terrestris, Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura) folosind BlastX. Amorsele și sondele au fost proiectate folosind instrumentul PrimerBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) (Tabelul 1). Produsul PCR corespunzător secvenței GFP a fost amplificat din plasmida pJL24. PCR-urile au fost efectuate folosind proceduri standard (Sambrook, 2012) cu GoTaq ® ADN polimerază (Promega Corporation, Madison, WI). Fragmentele au fost analizate pe 1% geluri de agaroză conținând 1% ADN sigur SYBR ® (Invitrogen ®). Secvențele de amplicon au fost confirmate prin secvențierea.