Expresia diferențială a proteinelor marchează trecerea de la infecția cu Opisthorchis viverrini la

Găsiți acest autor pe Google Scholar
Găsiți acest autor pe PubMed
Căutați acest autor pe acest site
Pentru corespondență: [email protected]

rezumat

Introducere

(A) Un model de hamster de CCA a fost utilizat pentru a identifica proteinele neregulate la hamsterii cu CCA indusă de Ov și la hamsterii infectați cu Ov (stare „inflamată”). Pentru a provoca CCA experimentală indusă de Ov (grupul „CCA indus de Ov”), hamsterii au fost infectați cu ov metacercariae și li s-a suplimentat dieta cu NDMA. Grupul „infectat cu ov” a fost infectat cu ov, dar nu a primit NDMA; () Ficatele hamsterului au fost resecate și iTRAQ și spectrometria de masă tandem au fost utilizate pentru a profila nivelurile de exprimare a proteinelor. Anticorpii pentru cinci proteine au fost apoi folosiți pentru a valida descoperirile iTRAQ atât în țesutul hamster, cât și în cel uman, folosind imunoblotarea și imunohistochimia.

Proceduri experimentale

Proiectare experimentală și raționament statistic

Au fost efectuate experimente iTRAQ cantitative pe preparate de proteine hepatice întregi din trei grupuri de hamsteri: grupuri „normale”, „CCA induse de ov” și „infectate cu ov” folosind trei replici biologice din fiecare grup. Pentru verificare în țesutul hepatic al hamsterului s-au efectuat experimente Western blot și analize imunohistochimice folosind patru replici biologice din fiecare dintre cele trei grupuri experimentale. Toate țesuturile CCA umane au fost obținute cu consimțământul informat de la pacienții de la spitalul Srinagarind, Universitatea Khon Kaen, Thailanda. Pentru experimentele Western blot în țesutul CCA uman, au fost utilizate șapte replici biologice și în fiecare replică a fost utilizat țesutul non-tumoral adiacent ca control. Proteinele candidate au fost verificate în continuare folosind analiza IHC pe un țesut care conține TMA de la 68 de pacienți cu CCA, 48 de bărbați și 20 de femei. Scopul acestui studiu a fost identificarea potențialilor potențiali pentru studii ulterioare, iar numărul eșantioanelor a fost în principal ghidat de 1) costurile reactivilor; și 2) disponibilitatea eșantionului.

Parazit și țesut animal

Ov metacercariae au fost obținute de la pești ciprinoizi infectați în mod natural în provincia Khon Kaen, Thailanda, folosind metode stabilite [8]. Pe scurt, peștii au fost digerați cu 0,25% pepsină-HCI și metacercariae izolate din suspensia rezultată. Metacercariae au fost examinate microscopic, s-au folosit chisturi numărabile și viabile pentru infectarea hamsterilor (Mesocricetus auratus). Toate probele de țesut animal au fost prelevate de la hamsteri utilizați într-un studiu imunohistochimic al CCA indus de Ov descris în [8] și aprobat de Comitetul de etică animală al Universității Khon Kaen, Thailanda (AEKKU 22/2557). Proiectul experimental este prezentat în Fig. 1A. Hamsterii au fost întreținuți la unitatea de cercetare a animalelor de la Facultatea de Medicină, Universitatea Khon Kaen, utilizând protocoale aprobate de Comitetul de Etică Animală al Universității Khon Kaen.

CCA indusă de ov la hamsterii aurii sirieni

Doisprezece hamsteri de aur masculi sirieni (Mesocricetus auratus) cu vârsta cuprinsă între 4-6 săptămâni au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupe de patru animale: 1.) grupul „Normal”, care a primit o dietă convențională murină (CP-SWT, Thailanda); 2.) grupul „CCA indus de ov”, care a fost infectat cu 50 ov metacercariae prin inoculare orală și a alimentat dieta de control suplimentată cu NDMA în primele două luni ale studiului (administrat în apă disponibilă ad libitum la 12,5 ppm); și 3.) grupul „infectat cu ov”, care a fost infectat cu 50 ov metacercariae prin inoculare orală și a alimentat dieta de control.

Țesutul pacientului

Țesuturile hepatice umane au fost preparate așa cum este descris în [14]. Consimțământul informat scris a fost obținut de la 68 de pacienți cu CCA, 48 de bărbați și 20 de femei, care au suferit o rezecție hepatică la spitalul Srinagarind, Universitatea Khon Kaen, Thailanda în perioada 1999-2010 (HE571283). Pacienții au avut o vârstă medie în ani de 57 ± 7,7 (38-74 ani). Comitetul de etică pentru cercetarea umană, Universitatea Khon Kaen, a aprobat protocoalele de studiu pentru obținerea probelor de ficat din biobancă a Centrului de Cercetare pentru Fluke și Colangiocarcinom hepatic (HE571294). Țesutul hepatic înghețat din șapte cazuri de tumori asociate (non-tumorale și tumorale adiacente) au fost utilizate pentru Western blot și țesuturile hepatice încorporate în parafină din aceleași cazuri au fost utilizate pentru analiza imunohistochimică. Microarraysurile de țesuturi (TMA) au fost construite de către Departamentul de Patologie, Facultatea de Medicină, Universitatea Khon Kaen, așa cum s-a descris anterior [15]. TMA-urile conțineau 68 de cazuri de CCA umane. Pentru a confirma prezența țesutului tumoral intact, o secțiune colorată cu H&E a blocului TMA a fost pregătită și revizuită de doi patologi independenți. Diagnosticul pacienților cu CCA a fost evaluat prin date clinice, analiza imagistică, markeri tumorali și patologie.

Purificarea proteinelor din ficatul hamsterului

Țesutul hepatic de hamster (100 mg) din fiecare hamster din fiecare grup a fost suspendat în 600 ofl de tampon de liză (7M uree, 2M tiourea, 4% (greutate/volum) CHAPS și 40 mM Tris-Base) și omogenizat cu un omogenizator cu microtuburi la 4 ° C timp de 5 min. Proba a fost sonicată timp de 1 min și incubată pe gheață timp de 30 min. Probele solubilizate au fost centrifugate la 12.000 × g timp de 20 minute la 4 ° C. Probele de proteine au fost precipitate cu 6 volume de acetonă rece la -20 ° C peste noapte. Proteinele au fost apoi peletizate folosind centrifugarea la 8.000 × g la 4 ° C timp de 10 min și peletele resuspendate în bicarbonat de trietilamoniu 0,5M (TEAB) pH 8,5 (Sigma-Aldrich) și 0,1% SDS. Proteinele au fost cuantificate prin testul proteinei Bradford (Bio-Rad) folosind recomandările producătorilor.

Reducere, alchilare și etichetare iTRAQ

Proteinele hepatice totale din trei replici biologice au fost analizate în trei experimente iTRAQ. Proteinele hepatice (100 pg) de la trei hamsteri din fiecare grup au fost reduse, alchilate și marcate folosind iTRAQ 8PLEX Multiplex Kit (AB Sciex, SUA). Pe scurt, probele de proteine au fost reduse cu 10 mM ditiotreitol la 60 ° C timp de 1 oră și alchilate în 50 mM iodoacetamidă sau metil metaniosulfonat (MMTS) la 37 ° C timp de 30 min. Proteinele au fost apoi digerate cu 2 ug de tripsină la 37 ° C timp de 16 ore. Reactivii de marcare iTRAQ au fost preparați prin adăugarea a 50 pl de izopropanol la fiecare flacon și aceștia au fost apoi folosiți pentru a marca probele de peptide timp de 2 ore la temperatura camerei. Peptidele marcate au fost combinate în trei amestecuri, reprezentând trei replici biologice, fiecare conținând patru probe de peptide („CCA indusă de Ov”, „infectată cu Ov” și două canale de control). După etichetare, amestecurile de peptide au fost curățate folosind coloane de schimb ionic HiTrap (GE Healthcare) și desalinizate folosind un cartuș Sep-Pak Vac C18 (Waters, SUA). Fracțiile curățate au fost apoi liofilizate înainte de OFFGEL ™ .