Exercițiile fizice atenuează activarea transcripțională indusă de post a genelor metabolice în schelet

Laboratorul John B. Pierce,

Departamentul de Fiziologie Celulară și Moleculară, Școala de Medicină a Universității Yale, New Haven, Connecticut 06519

Abstract

Postul determină o creștere progresivă a metabolismului lipidic în mușchiul scheletic. Pentru a determina efectele postului asupra reglării transcripționale a genelor importante pentru controlul metabolic în mușchiul scheletic compus din diferite tipuri de fibre, nucleii de la șobolanii de control și cei de post (24 și 72 de ore) au fost supuși unei analize nucleare funcționale folosind un RT-PCR -tehnica bazata. Postul a crescut ( mușchiul scheletic, în virtutea masei sale și a necesarului total de energie, este țesutul primar responsabil pentru eliminarea glucozei și lipidelor din circulație și joacă astfel un rol cheie în menținerea homeostaziei metabolice generale (33, 42). Recunoașterea tot mai mare a faptului că modificările subtile ale echilibrului energetic, atunci când sunt luate în considerare pe perioade prelungite de timp, reprezintă un factor de risc semnificativ pentru dezvoltarea unor anomalii metabolice precum rezistența la insulină, hipertrigliceridemia, obezitatea și diabetul zaharat non-insulinodependent a intensificat căutarea pentru semnalizarea celulară specifică și proteine reglatoare care pot influența controlul metabolic al mușchilor scheletici (32).

Cele mai multe progrese în înțelegerea noastră a modului în care pot fi sesizate provocări acute la nivelul metabolismului intermediar și la care se poate răspunde la nivel molecular au apărut din activitatea în ficat, rinichi și țesut adipos. De exemplu, tranziția de la starea alimentată la starea de post activează în mod dramatic transcrierea unui număr de gene care codifică enzime cu roluri care limitează rata în gluconeogeneza hepatică, oxidarea acizilor grași și ketogeneza. Ajutată de studii moleculare la șoareci transgenici și diverse sisteme de cultură celulară, caracterizarea detaliată a elementelor de reglare din regiunile promotor ale acestor gene a condus la identificarea proteinelor cheie de semnalizare și a factorilor de transcripție care răspund la diverse manipulări nutriționale și/sau hormonale (13, 19.30).

Materiale.

Șobolani Sprague-Dawley masculi au fost crescuți în casă sau au fost cumpărați de la Charles River Laboratory (Wilmington, MA). Toți șobolanii au fost adăpostiți individual într-o cameră cu temperatură (22 ° C) și lumină controlată (întuneric 9:00 AM-9: 00 PM) și li s-a oferit acces gratuit la alimente (dieta Purina Rodent) și apă. Compușii radio-marcați au fost achiziționați de la Amersham Pharmacia Biotech. Toate celelalte substanțe chimice au fost de calitate biologică moleculară și au fost achiziționate de la Boehringer Mannheim, GIBCO-BRL, Promega sau Sigma Chemical.

Proiectare experimentală.

Șobolanii cântăreau 340-360 g în momentul fiecărui experiment. Hrana a fost îndepărtată de la șobolanii experimentali la începutul ciclului întunecat (9:00 AM) și a fost reținută timp de 24 sau 72 de ore, menținând în același timp accesul liber la apă. Șobolanii de control au continuat să aibă acces gratuit la alimente și apă. Într-un al doilea set de experimente, cererea metabolică a crescut în timpul postului (24 de ore) prin faptul că șobolanii au efectuat două perioade de 2 ore de exerciții de rulare (18 m/min, înclinare de 5 °) începând cu 1 și 6 ore după îndepărtarea alimentelor, 10: 00 AM și 15:00). Șobolanii au fost uciși la 24 de ore (∼16 h după ultima luptă de exerciții) și au fost comparați cu șobolani de control suplimentari și 24 de ore post. La finalizarea experimentelor, șobolanii au fost anesteziați (35 mg/kg ip pentobarbital sodiu) și așezați pe un tampon de încălzire pentru a menține temperatura corpului în timpul intervenției chirurgicale.

Izolarea nucleelor.

Determinarea ratei de transcriere prin RT-PCR.

RT al ARN născut a fost efectuat utilizând sistemul Superscript II RNase H - (GIBCO-BRL) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 18 μl de ARN au fost amestecate cu 1,5 μl oligo (dT) 12-18 (500 ng/μl), încălzite la 70 ° C timp de 10 min și răcite rapid pe gheață timp de 5 min. După rotirea condensului, 6 μl de tampon de reacție 5 × (250 mM Tris, pH 8,3, 375 mM KCl și 15 mM NaCl), 3 μl de 0,1 M DTT și 1,5 μl de amestec dNTP (10 mM fiecare din dATP, dCTP, dGTP și dTTP) au fost adăugate la fiecare probă. După o preincubare de 2 minute la 42 ° C, s-au adăugat 1,0 pl de Superscript II și probele au fost incubate la 42 ° C timp de 50 min. Enzima a fost inactivată prin incubare la 70 ° C timp de 15 min. Pentru a ține cont de diferențele în conținutul de nuclee dintre probe înainte de reacția de testare, produsele RT au fost diluate cu H2O fără nuclează pe baza conținutului relativ de ADN genomic al fiecărui preparat de nuclee (vezi mai jos). Volumul mediu a fost stabilit la 150 μl.

Tabelul 1. Amorsele și condițiile de reacție utilizate pentru PCR pe RT-ARN nuclear

UCP3, proteina 3 de decuplare; LPL, lipoproteină lipazică; CPT I, carnitin palmitoiltransferaza I; LCAD, acil-CoA dehidrogenază cu lanț lung; MCAD, acil-CoA dehidrogenază cu lanț mediu; HK II, hexokinaza II; [MgCl2], concentrare MgCl2; AT, temperatura de recoacere.

Izolarea și cuantificarea ADN-ului genomic.

Pentru a corecta diferențele inițiale în conținutul de nuclee dintre probe, ADN-ul genomic a fost izolat dintr-o porțiune din fiecare probă de nuclee în aceeași zi cu reacția nucleară. O alicotă de 20 μl de nuclee a fost plasată în 380 μl de tampon de digestie (10 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS și 100 μg de proteină K) și incubat la 50 ° C pentru ( 6 ore. După adăugarea a încă 380 μl de H2O fără nuclează, ADN-ul a fost izolat prin extracție cu un volum egal de fenol-cloroform-isoamil OH (25: 24: 1), separat prin centrifugare (12.000 g, 4 ° C), și precipitat din faza apoasă rezultată prin adăugarea de 1 10 vol 3 M NaOAc -, 100 μg de ARNt (pentru a ajuta la vizualizarea peletelor de ADN) și 2,5 vol EtOH 100%. ADN-ul a fost peletat (12.000g, 10 min, 4 ° C), clătit cu 70% EtOH și resuspendat în 50 μl de 10 mM Tris și 1 mM EDTA (TE, pH 8,0) peste noapte la 4 ° C. Cuantificarea relativă a ADN-ului genomic (conținutul de nuclee inițiale) a fost determinată prin amplificarea PCR a genei β-actină. Aceste date au fost utilizate pentru a ajusta diluțiile finale ale produselor de reacție RT corespunzătoare din reacțiile nucleare de funcționare (înainte de PCR, vezi mai sus) pentru a ține cont de diferențele mici în conținutul de nuclee inițiale între probe.