Discriminarea între Streptococcus pneumoniae și Streptococcus mitis pe baza sortării acestora

Institutul de cercetare pentru medicină fizico-chimică, Moscova, Rusia

Autorul corespunzator: LN Ikryannikova, Institutul de Cercetare pentru Medicină Fizico-Chimică al Ministerului Sănătății Publice al Federației Ruse, str. 119992 Malaya Pirogovskaya, 1a, Moscova, Rusia

Institutul de cercetare pentru medicină fizico-chimică, Moscova, Rusia

Agenția Națională de Farmacologie Clinică și Farmacie, Moscova, Rusia

Institutul de cercetare pentru medicină fizico-chimică, Moscova, Rusia

Agenția Națională de Farmacologie Clinică și Farmacie, Moscova, Rusia

Institutul de cercetare pentru infecțiile copiilor, Saint Petersburg, Rusia

Universitatea Medicală de Stat din Sankt Petersburg, Sankt Petersburg, Rusia

Institutul de cercetare pentru medicină fizico-chimică, Moscova, Rusia

Agenția Națională de Farmacologie Clinică și Farmacie, Moscova, Rusia

Institutul de cercetare pentru medicină fizico-chimică, Moscova, Rusia

Agenția Națională de Farmacologie Clinică și Farmacie, Moscova, Rusia

Institutul de cercetare pentru infecțiile copiilor, Saint Petersburg, Rusia

Universitatea Medicală de Stat din Sankt Petersburg, Sankt Petersburg, Rusia

Institutul de cercetare pentru medicină fizico-chimică, Moscova, Rusia

Abstract

Introducere

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis, Streptococcus pseudopneumoniae și Streptococcus oralis sunt specii strâns înrudite de v iridan g roup s treptococci (VGS) care colonizează cavitatea bucală umană; cu toate acestea, proprietățile lor patogene diferă semnificativ. In timp ce S. pneumoniae este un agent patogen uman major asociat cu pneumonie dobândită în comunitate, meningită și otită medie, alți reprezentanți ai acestui grup sunt comensali și pot provoca infecții numai atunci când au acces la fluxul sanguin sau la o gazdă imunocompromisă. Laboratoarele clinice trebuie să poată diferenția cu exactitate S. pneumoniae din alte VGS întâlnite frecvent în probele clinice pentru a facilita terapia antimicrobiană adecvată. Cu toate acestea, metodele convenționale fenotipice, cum ar fi morfologia coloniilor, solubilitatea biliară și testarea sensibilității la optochină, precum și sistemele comerciale (API 20 Strep și Vitek 2; bioMe′rieux, Marcy l'Etoile, Franța), nu oferă întotdeauna o identificare precisă 1- 4 .

O varietate de gene au fost utilizate ca ținte pentru o discriminare bazată pe PCR a VGS: pneumolizină (stratul) 5, autolizină (lytA) 6, antigen de suprafață pneumococic A (câineA) 7 și fragmentul ADN cu funcție necunoscută Spn9802 8. Cu toate acestea, aplicarea acestei strategii este complicată de rapoartele care Streptococ mitis și Streptococcus oralis adăpostește genele care codifică autolizina și pneumolizina 9-11. Analiza secvenței a genelor ARNr 16S, de asemenea, nu poate fi aplicată pentru discriminarea VGS datorită asemănării 99% în compoziția nucleotidică a genelor ARNr 16S la aceste bacterii 12, 13. Analiza secvenței de rnpB (Subunitatea ARN a endonuclează P), sifon (superoxid dismutază dependentă de mangan), tuf (factor de alungire Tu), groESL (proteinele de șoc termic) și rpoGenele B (b - subunitatea ARN polimerazei bacteriene) sunt mai promițătoare, dar datele sunt insuficiente pentru concluziile finale.

În prezent, identificarea cea mai fiabilă a VGS poate fi realizată prin utilizarea echivalenței multimetrice a analizei (MLSA) 14. Această abordare se bazează pe construirea unui copac filogenetic pe secvențele concatenate a șapte fragmente de gene de menaj și afișarea relației clonale dintre tulpinile necunoscute în studiu și tulpinile stocate în bazele de date publice. http://viridans.emlsa.net/ permite ca tulpinile streptococice să fie atribuite speciilor din VGS. Corect S. pneumoniae identificarea poate fi realizată, de asemenea, utilizând baza de date mlst.net, care a fost concepută în principal pentru tiparea intraspecie a pneumococilor 15. Din păcate, MLSA este relativ scump și consumă mult timp.

Recent a fost sugerată profilarea directă a bacteriilor prin ionizare prin desorbție cu laser matricială asistată - spectrometria de masă în timp (MALDI - TOF MS) a fost sugerată ca instrument pentru identificarea rapidă a diferitelor bacterii. Din păcate, folosind baza de date Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Germania) streptococ speciile mitis/oralis pot fi identificate eronat ca S. pneumoniae, datorită asemănării excepționale a spectrelor lor de masă 16-19 .

În acest studiu, s-au aplicat o serie de algoritmi de clasificare matematică pentru a sorta spectrele de masă ale VGS prin selectarea unui set de vârfuri de masă care discriminează izolatele caracterizate fenotipic și genetic ale diferitelor specii VGS. Din aceste clase, au fost generate o serie de modele de clasificare și comparate de parametrii de sensibilitate și specificitate. În cele din urmă, modelele de succes au fost testate orb pe cele selectate aleator S. pneumoniae și S. mitis tulpini.

Metode

Tulpini

Un total de 62 VGS au fost incluse în studiu. Treizeci și patru dintre ele au fost identificate în studiul nostru anterior ca fiind S. mitis iar trei ca. S. oralis 20. Douăzeci și cinci de izolate au fost identificate ca fiind S. pneumoniae pe baza solubilității biliare, a sensibilității la optochină și a rezultatelor pozitive ale testului ‘Slidex ® pneumo-kit’ (bioMerieux ®, Marcy - l’Etoile, Franța). Pentru S. pneumoniae izolate, serotipurile au fost determinate folosind antiseruri obținute de la Staten Serum Institute (Copenhaga, Danemarca) conform recomandărilor producătorului. Toate izolatele VGS au fost depozitate la -80 ° C în flacoane CRYOBANK ™ (Copan, Italia).

Înainte de analiza spectrometriei de masă și studiile genetice, izolatele au fost subculturate pe agar Columbia (Oxoid Ltd, Basingstoke, Marea Britanie) cu adăugare de 5% sânge de oaie (incubație peste noapte la 35 ° C în aer cu 5% CO2) și teste fenotipice (solubilitate biliară, sensibilitatea la optochină și testul „Slidex® pneumo-kit”) au fost repetate. Un test de sensibilitate la optochină a fost efectuat folosind discurile standard de diagnosticare cu optochină (Centrul de Cercetare în Farmacoterapie, St Petersburg, Rusia), în aer cu 5% CO2.

Analiza genelor: scheme MLST și MLSA

Pentru manipulările genetice, ADN-ul streptococic a fost extras folosind kitul „DNA - express” („Lytech” Ltd, Moscova, Rusia), în conformitate cu instrucțiunile producătorului. MLST și MLSA au fost efectuate așa cum au fost descrise de Enright și Spratt 15 și de Bishop și colab. 14, respectiv. Rezultatele au fost analizate folosind bazele de date MLST (http://www.mlst.net) și MLSA (http://viridans.emlsa.net/).