Crioconservarea eficientă a celulelor stem neuronale sau progenitoare fără ser sau proteine de către
Informații despre articol
1 Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.Unitatea de conservare a temperaturii scăzute, National University Medical Institutes, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Block MD 11 # 03-01C, 10 Medical Drive, Singapore 117597. Tel: + 65- 6516-3359; Fax: + 65-6773-5461; E-mail: [email protected] Departamentul de farmacologie, Școala de medicină Yong Loo Lin, Universitatea Națională din Singapore, 10 Medical Drive, Singapore 117597. Tel: + 65-6516-8864; Fax: + 65-6873-7690; E-mail: [e-mail protejat]
Abstract
Introducere
Se anticipează că protocoalele de cultură și stocare sterile și fără xeno vor fi o cerință pentru realizarea finală a aplicației clinice a NSPC-urilor. Protocoalele de criostocare sterile și reproductibile ar facilita, de asemenea, cercetarea de bază. Așa cum s-a discutat în domeniile cercetării celulelor stem mezenchimale și embrionare [pentru revizuire vezi (13, 23, 24)], utilizarea derivaților de origine animală și a altor componente organice crește riscul de contaminare și variabilitate de la lot la lot. Având în vedere cerința privind sterilitatea, am demonstrat că crioconservarea materialului biologic prin vitrificare poate fi realizată folosind numai aditivi nonbiologici (17, 19, 22, 32, 38). De asemenea, am dezvoltat un protocol folosind o configurație sigilată „paie în paie” (250 μl paie sterilă așezată în 500 μl paie), care permite menținerea sterilității în timpul crioconservării (18, 19). Protocolul este atât rentabil, cât și în timp, deoarece nu are nevoie de aparate scumpe de răcire lentă și necesită doar imersie directă în azot lichid pentru răcire.
Materiale și metode
Cultura NSPC-urilor
Șoarecii C57BL/6J gravide au fost anesteziați și fetusii embrionari din ziua 14 (E14) au fost extrși chirurgical. Hipocampii au fost disecați și digerați în soluție de tripsină-EDTA 0,25% (Gibco, CA, SUA) timp de 30 de minute cu triturare la fiecare 15 minute.
De două ori volumul de PBS a fost adăugat pentru a opri digestia și țesuturile au fost cernute cu un filtru de celule de 70 μm. Probele au fost centrifugate pentru a peleta celulele, iar celulele au fost apoi placate cu mediu de neurosferă. Mediul neurosferei a constat din DMEM/F12 (Gibco) suplimentat cu supliment N2 (Gibco), 20 ng/ml EGF (Gibco) și 10 ng/ml bFGF (Gibco). După 2-3 săptămâni în cultură au fost prezente neurosfere vizibile și cultura a fost trecută. Pentru trecere, neurosferele au fost lăsate să se așeze într-un tub de microcentrifugă și apoi s-au disociat mecanic folosind o pipetă de 200 μl înainte de a le înlocui în mediu neurosferic proaspăt. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității Naționale din Singapore și au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, National Institutes of Health, SUA.
Vitrificarea neurosferelor
Figura 1. Reprezentarea schematică a procedurilor de vitrificare - încălzire și diluare pentru crioconservarea NSPC-urilor. Concentrațiile totale de solut se referă la soluțiile EG, cu excepția soluției indicate de un asterisc (*), care constă din EG + zaharoză (40% v/v EG și 0,6 M zaharoză).
Încălzirea neurosferelor și diluarea crioprotectorului
Paie care conțin neurosfere au fost încălzite prin imersiune într-o baie de apă la 38 ± 0,5 ° C timp de 30 s cu agitare continuă. Apoi neurosferele au fost despachetate și expulzate în zaharoză 1 M în DMEM/F12 într-un tub de centrifugă de 15 ml. Concentrația zaharozei a fost redusă treptat mai întâi la 0,7 M prin diluare cu zaharoză 0,25 M în DMEM/F12 și ulterior cu 0,175 M după diluarea treptată cu DMEM/F12. Duratele etapelor de încălzire și diluare sunt prezentate schematic în Figura 1. A durat întreaga procedură de diluare
15 minute. Toate tratamentele au fost efectuate la temperatura camerei (23 ± 2 ° C). Neurosferele au fost apoi lăsate să se scufunde. Soluția în exces a fost apoi îndepărtată și neurosferele au fost spălate în mediu de cultură neurosferică înainte de a fi plasate în incubator. După 30 de minute au fost transferați pe medii de cultură proaspete pentru cultura de rutină până la o analiză suplimentară.
Test pentru markeri de celule stem neuronale
Pentru a determina dacă vitrificarea a afectat starea neuronală sau starea celulelor progenitoare, NSPC-urile disociate au fost placate pe diapozitive acoperite cu poli-L-ornitină/fibronectină într-un monostrat și menținute timp de 3 zile în mediu neurosferic. Progenitorul sau celulele stem au fost apoi fixate prin tratament cu paraformaldehidă 4% timp de 20 de minute. Imunomarcarea a fost efectuată secvențial folosind anticorpi anti-Sox2 (AB5603, Chemicon, Tenecula, CA, SUA) și anti-nestin (MAB353, Chemicon) pentru identificarea markerilor neuronali ai celulelor stem sau progenitori. Anticorpii secundari Alexa Fluor conjugați la fluorescență (Invitrogen, CA, SUA) au fost folosiți pentru a vizualiza anticorpii primari și lamelele de acoperire au fost contracolorate cu DAPI în mediul de montare Prolong Antifade Gold (Invitrogen). Celulele imunocolorate au fost apoi imaginate prin scanare secvențială cu un microscop confocal (LSM 510, Carl Zeiss Microimaging GmbH, Germania).
Testul proliferării celulare
Pentru a testa rata de proliferare celulară a NSPC-urilor, neurosferele martor au fost spălate bine folosind mediu de cultură, înainte de disociere și colorare, imitând procesul de diluare al grupului vitrificat pentru consistența procedurii. Neuroesferele au fost disociate folosind soluție de 0,25% tripsină-EDTA și celulele au fost replatate pe lamele acoperite cu poli-L-ornitină/laminină. Celulele au fost lăsate să adere la lamele de acoperire și 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU; Sigma-Aldrich, MO, SUA) a fost apoi adăugată la mediul de cultură la o concentrație finală de 10 μM și incubată cu NSPC disociate pentru 24 h. Celulele au fost apoi fixate cu paraformaldehidă 4% timp de 20 min. Imunomarcarea a fost efectuată pentru a detecta încorporarea BrdU utilizând un anticorp anti-BrdU (1: 100, BRD.3, Neomarkers, Lab Vision Corporation, CA, SUA) și a fost detectată folosind anticorpul secundar conjugat Alexa Fluor 555 (Invitrogen). Celulele au fost contracolorate cu DAPI pentru a dezvălui toate nucleele. Celulele au fost imaginate prin scanare secvențială cu un microcop confocal (Fluoview 1000, Olympus, Japonia). Un investigator orb de condițiile de tratament a numărat numărul de celule imunoreactive BrdU și nuclei DAPI-pozitivi, iar numărul de celule BrdU-pozitive a fost exprimat ca procent din numărul total de celule.