Articol complet Depozitul specific de adipocite-matrice extracelulară diabolică metabolică la obezitatea murină

Scurt raport

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Citații
  • Valori
  • Licențierea
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

ABSTRACT

Țesuturile adipoase subcutanate (SAT) și viscerale (TVA) au fenotipuri metabolice distincte. Am emis ipoteza că matricea extracelulară (ECM) reglează diferențele specifice depozitului în funcția metabolică a adipocitelor la obezitatea murină. Preadipocitele TVA și SAT de la șoareci slabi sau obezi au fost supuse diferențierii adipogene în cultura standard 2D pe plăci de cultură de țesut plastic sau în cultură 3D în ECM, urmată de profilarea metabolică. Adipocitele din TVA în raport cu SAT s-au manifestat afectarea absorbției glucozei stimulate de insulină și scăderea capacității adipogene. În cultura 3D-ECM-adipocite, ECM a reglementat metabolismul adipocitelor într-o manieră specifică depozitului, cu ECM SAT salvând defecte în absorbția glucozei și expresia genei adipogene în adipocitele TVA, în timp ce ECM TVA a afectat expresia genei adipogene în adipocitele SAT. Aceste descoperiri demonstrează că diabolica ECM-adipocite reglează diferențele specifice depozitului în disfuncția metabolică a adipocitelor la obezitatea murină.

depozitul

Introducere

Materiale și metode

Experimentele au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Michigan, în conformitate cu reglementările AAALAC. Șoarecii de sex masculin C57Bl/6 de opt săptămâni au fost hrăniți cu dietă normală (ND) sau dietă bogată în grăsimi (HFD) (60% calorii grase, Research Diets Inc., Cat # D12492) timp de 8 săptămâni. Numărul șoarecilor utilizați pentru fiecare experiment este descris în figuri. Greutățile corpului au fost măsurate săptămânal. La sfârșitul protocolului de hrănire, a fost efectuat un test de toleranță la glucoză (GTT) așa cum este descris [13], urmat de eutanasie și colectarea TVA (tampon de grăsime epididim) și SAT (tampon de grăsime inghinal/flanc).

Cultură de celule

In vitro teste metabolice

Zona adipocitelor

TVA și aria adipocitelor SAT (µm 2) au fost măsurate folosind secțiuni fixe colorate cu hematoxilină/eozină, realizate pe un microscop fluorescent Olympus IX-81 folosind canalul roșu Texas (595-605 nM). Imaginile au fost capturate ca imagini multiple la scară de gri TIFF și analizate cu software-ul ImageJ. Suprafața adipocitelor a fost măsurată în 200-500 de celule din mai multe lame pentru fiecare specimen și a fost calculată în medie pentru fiecare probă de țesut.

Acumularea de lipide

Microscopia electronică de scanare [12] și colorarea cu ulei roșu-O (Sigma Aldrich Inc., Cat # O0625) au fost utilizate pentru a imagina 3D-ECM/adipocite pentru a evalua acumularea lipidelor după diferențiere. AdipoRed (Lonza Inc., Cat # PT-7009) a fost utilizat pentru a cuantifica acumularea de lipide adipocitare în culturi de plastic 2D și standardizat prin proteine ​​totale, măsurat prin testul Pierce BCA (ThermoFisher Scientific Inc., Cat # 23225).

PCR cantitativă (qPCR)

ARN din SAT și TVA a fost extras în Trizol și adipocite din culturi 2D și 3D folosind RNeasy Mini Kit și RNeasy Fibrous Tissue MiniKit (Qiagen Inc., Cat # 74104, 74704), respectiv. Puritatea, concentrația și integritatea ARNm au fost evaluate utilizând un spectrofotometru NanoDrop 1000 (ThermoFisher Scientific Inc., Cat # ND-ONE-W). De remarcat, extracția ARN-ului din „ECM gol” nu este însămânțată cu celule fără a produce ARN detectabil sau amplificabil, confirmând îndepărtarea completă a ARN din preparatele ECM înainte de însămânțarea cu celule. Cantități egale de ARN din SAT și TVA întregi sau adipocite din sistemele de cultură 2D și 3D au fost transcrise invers folosind un kit de arhivă ADNc de mare capacitate (Applied Biosystems Inc., Cat # 4368814). ADNc a fost studiat cu qPCR folosind teste și reactivi de expresie a genei Taqman (Life Technologies Inc.) utilizând un termociclator StepOnePlus (Applied Biosystems Inc., Cat # 4376600). Datele sunt prezentate ca modificări ale pliurilor calculate din diferențele medii ale celor mai mici pătrate în conformitate cu metoda 2 −ΔΔCT [15] și normalizate la media genei de menaj β2-microglobulină (B2 M), pentru care valorile CT nu au variat între adipos depozite de la șoareci HFD, nici între diferitele potriviri ECM-adipocite (P> 0,05). O valoare CT de 40 a fost atribuită valorilor CT subminate pentru calculele modificării pliurilor.

Analiza absorbției glucozei (GUA)

Răspunsurile la insulină au fost evaluate cu GUA așa cum este descris [12]. Pe scurt, adipocitele din culturile de plastic 2D sau 3D-ECM au fost înfometate cu ser peste noapte, apoi incubate cu PBS/2% BSA la 37 ° C timp de 2 ore, urmată de stimulare a insulinei (200 nM) 37 ° C timp de 40 de minute. Absorbția glucozei a fost evaluată prin absorbția 2-deoxi glucozei (0,1 mM; Sigma-Aldrich Inc., Cat # D6134) și a deoxi-d-glucozei-2- [1,2-3 H (N)] [2 μCi/ml; PerkinElmer Inc ., Cat # NET549001MC) timp de 40 de minute și măsurată cu numărarea scintilației (număr pe minut, cpm) normalizată la proteina celulară (DC ™ Protein Assay, Bio-Rad, Inc., Cat # 5000112).

analize statistice

Rezultate

Obezitatea induce rezistența sistemică la insulină și modifică profilul de exprimare a genei ECM a țesutului adipos

Un HFD de 8 săptămâni a determinat creșterea greutății corporale cu 5,30 ± 1,35 g (medie ± SEM; P = 0,001, Figura 1 (a)), creșterea greutății depozitului TVA și SAT, scăderea masei hepatice (Figura 1 (a, b)), și rezistența sistemică la insulină, măsurată prin GTT (Figura 1 (c)). În comparație cu ND, HFD a indus hipertrofie adipocitară care a fost mai mare în TVA decât SAT (Figura 1 (e)) și modificări specifice depozitului în expresia țesutului adipos a mai multor gene ECM și adipogene (Figura 1 (f)): COL1A1, COL4A1 și LOX au fost reglementate în sus în SAT, în timp ce COL3A1, LAMB1 și FN1 au fost suprareglementate atât în ​​TVA, cât și în SAT; MMP2, MMP9, și VTN au fost subregulate în SAT și TVA; CTGF expresia a fost crescută în SAT, dar a scăzut în TVA. Genele adipogene CEBPA, PPARG, FASN, ATGL, ADIPOQ, și GLUT4 au fost subregulate în TVA, dar nu SAT ca răspuns la HFD, în timp ce FRUMOS expresia a fost crescută în ambele depozite ca răspuns la HFD. Aceste date demonstrează că obezitatea afectează sensibilitatea sistemică la insulină, induce hipertrofia țesutului adipocitar și induce un model de expresie genetică în concordanță cu depunerea crescută a ECM în ambele depozite și scăderea adipogenezei în TVA, dar nu și în SAT.