Retinopatia într-un model de șobolan diabetic tip 2 indus de dietă și rolul modificărilor epigenetice

Abstract

Introducere

Prevalența mondială a diabetului crește într-un ritm rapid, iar în rândul populației cu diabet zaharat, diabetul de tip 2 reprezintă aproximativ 90% din toate cazurile din întreaga lume. Inactivitatea fizică, aportul de grăsimi trans și obezitate sunt considerate drept principalul factor care contribuie la creșterea diabetului (1,2). Creșterea rapidă a incidenței diabetului crește, de asemenea, povara globală a complicațiilor diabetice, inclusiv pierderea vederii datorată retinopatiei diabetice (3), iar modelele experimentale sunt cheia înțelegerii mecanismelor moleculare pentru intervențiile terapeutice.

Mediul diabetic crește stresul oxidativ și se consideră că stresul oxidativ joacă un rol major în dezvoltarea retinopatiei diabetice (12-14). În diabet, mitocondriile retiniene sunt deteriorate, iar deteriorarea ADN-ului este mai extinsă în regiunea buclei de deplasare (D-Loop) a ADNmt, regiunile importante pentru transcrierea și replicarea ADNmt. Mai mult, expresia multor gene retiniene și proteine asociate cu homeostazia mitocondrială este modificată (14,15). Modele experimentale au documentat că creșterea speciilor de oxigen reactiv citosolic (ROS) precede disfuncția mitocondrială (16), iar NADPH oxidaza 2 (Nox2) este una dintre enzimele majore asociate cu producția de ROS citosolică. Rac1, o proteină G cu greutate moleculară mică, este o componentă obligatorie a holoenzimei Nox2, iar în retinopatia diabetică, semnalizarea Rac1-Nox2-ROS este activată înainte de afectarea mitocondrială (17).

Cercetări recente au documentat că mecanismul enzimatic responsabil de modificările epigenetice, modificările care pot modifica expresia genelor fără a afecta secvența ADN, este, de asemenea, modificat în diabet (14,15,18). Enzimele responsabile de menținerea stării de metilare a ADN, ADN metil transferazele (Dnmts) și zece-unsprezece translocații metilcitozino dioxigenazele (Tets), sunt activate, iar ADNmt este hipermetilat în retină și vasculatura sa la rozătoarele diabetice de tip 1 și la donatorii umani cu retinopatie diabetică documentată (19). Cu toate acestea, nu este clar modul în care obezitatea/hiperlipidemia afectează metilarea ADN și mecanismele sale enzimatice în mediul hiperglicemic.

Un model de șobolan hiperglicemic indus cu conținut ridicat de grăsimi/streptozotocină (Stz) este utilizat acum pentru complicații neuronale și screening farmacologic (20,21), dar dezvoltarea retinopatiei diabetice în acest model animal nu este elucidată. Scopul nostru a fost investigarea dezvoltării retinopatiei diabetice la acest model animal diabetic de tip 2, care imită progresia normală și caracteristicile metabolice ale diabetului de tip 2 uman. Am investigat patologia vasculară a retinei și modificările funcționale într-un model de șobolan alimentat cu conținut ridicat de grăsimi de la 2 la 6 luni după hiperglicemia indusă de Stz și am comparat-o cu un model de șobolan diabetic de tip 1. Pentru a înțelege mecanismul molecular, leziunile mitocondriale și modificările epigenetice ale ADNmt și ale promotorului Rac1 sunt evaluate în microvasculatura retiniană din aceste modele animale diabetice.

Proiectare și metode de cercetare

Șobolanii masculi Sprague Dawley (în vârstă de 9 până la 10 săptămâni) au fost împărțiți în două grupuri; în timp ce șobolanii din grupa 1 au rămas pe șobolanul obișnuit (numărul de catalog 7001; Envigo, Indianapolis, IN) conținând 4,25% kcal ca grăsime, șobolanii din grupa 2 au fost plasați pe o dietă bogată în grăsimi (numărul de catalog D12451; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ) conținând 45% kcal ca grăsime. După 8 săptămâni la o dietă bogată în grăsimi, jumătate din șobolani au primit o doză mică de Stz (30 mg/kg greutate corporală [BW] i.p.) pentru a induce diabetul (T2D) (21,22). În același timp, jumătate din șobolani pe șobolanii obișnuiți (grupa 1) au fost, de asemenea, injectați cu 60 mg/kg BW Stz (T1D) (16), iar cealaltă jumătate au rămas martori normali (Norm); fiecare grup avea 12-16 șobolani. Șobolanii din grupurile T2D și HF au fost menținuți pe aceeași dietă bogată în grăsimi și grupurile T1D și Norm pe chow de șobolan normal pe tot parcursul experimentului. Au fost sacrificați la 2, 4 și 6 luni după administrarea Stz. Tratamentul animalelor a fost în conformitate cu liniile directoare ale Declarației Asociației pentru Cercetare în Viziune și Oftalmologie pentru utilizarea animalelor în cercetarea oftalmică și vizuală și a urmat liniile directoare instituționale.

Toleranță la glucoză și rezistență la insulină

Șobolanii au fost postiti peste noapte, au fost cantariti si li s-a administrat glucoza (2 g/kg iW p.p.). Glucoza din sânge a fost măsurată folosind benzi de reactiv glucoză-oxidază chiar înainte și 15–180 min după administrarea glucozei (22).

Sensibilitatea la rezistența la insulină a fost determinată prin administrarea de Humulin R (1 UI/kg iW p.p.) (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN) și măsurarea glicemiei lor 0-180 min după administrarea insulinei (23).

Profilul lipidic seric

Colesterolul seric și trigliceridele au fost cuantificate folosind truse comerciale de la Abcam (numere de catalog ab65390 și ab65336; Cambridge, MA), așa cum s-a descris anterior (8).