Leptina duodenală stimulează secreția de colecistochinină Diabetul

Dovezi ale unui ciclu de feedback pozitiv Leptină-Colecistochinină

  1. Sandra Guilmeau,
  2. Marion Buyse,
  3. Annick Tsocas,
  4. Jean Pierre Laigneau și
  5. André Bado
  1. De la Institutul Național al Sănătății și Cercetării Medicale (INSERM) Unité 410, Facultatea de Medicină Xavier Bichat, Paris, Franța
  1. Adresați cererile de corespondență și retipărire către Andre Bado, INSERM Unité 410, Facultatea de Medicină Xavier Bichat, 16, rue Henri Huchard, 75018 Paris, Franța. E-mail: badobichat.inserm.fr .

Dovezi ale unui ciclu de feedback pozitiv Leptină-Colecistochinină

Abstract

  • CCK, colecistochinina
  • ERK, kinază extracelulară legată de semnal
  • ERK-P, fosfo-ERK
  • INSERM, Institutul Național al Sfântului și al Cercetării Medicale
  • IR, imunoreactiv
  • MAPK, o proteină kinază activată cu mitogen
  • MEK, cinema MAPK
  • PI3-K, fosfoinozidă 3-kinază
  • RIA, radioimunotest
  • STAT, traductoare de semnal și activatori de transcriere.

Leptina, produsul genei ob, a fost raportată inițial ca fiind produsă de celulele adipoase (1). Este eliberat în fluxul sanguin și transportat prin bariera hematoencefalică în hipotalamus, unde activează receptori specifici de leptină (2,3) și reglează homeostazia energetică modificând aportul și cheltuielile de energie (4-6). Leptina reglează consumul de alimente prin mecanisme care implică discuții încrucișate între receptorii hipotalamici ai leptinei și diferite neuropeptide implicate în controlul hrănirii. Receptorul leptinei (Ob-R) este un membru al familiei gp130 de receptori de citokine. Apare în mai multe izoforme rezultate din îmbinarea alternativă a genei receptorului de leptină db (2,3). În prezent, se crede că izoforma lungă, Ob-Rb, poate activa traductoarele de semnal și activatorii căilor de transcripție (STAT), în timp ce atât Ob-Rb, cât și isoforma scurtă (Ob-Ra) pot transduce semnale prin substraturile receptorilor de insulină și prin căi de proteină kinază activată cu mitogen (MAPK) (7).

leptina

Semnalele care apar din tractul gastro-intestinal superior în timpul hrănirii sunt transmise creierului de nervul vag. Aceste semnale sunt componente cheie în controlul sațietății induse de masă. Colecistochinina (CCK) este secretată de celulele endocrine I duodenale și funcționează de obicei ca unul dintre aceste semnale de satietate pe termen scurt (8,9). Interesant este faptul că inhibarea indusă de leptină a consumului de alimente (10) și stimularea secrețiilor exocrine pancreatice (11) pot fi blocate de un antagonist al receptorilor CCK-1. Aceste date sugerează că CCK endogen este implicat în aceste efecte, funcționând prin receptorii CCK-1. Cu toate acestea, nu se știe în prezent dacă leptina modulează direct eliberarea CCK.

Leptina este produsă și de stomac (12-14) și este secretată în principal în sucul gastric după CCK la șobolani (12,15) și după secretină sau stimulare vagală la om (14,16). O parte din leptina derivată din stomac nu este pe deplin degradată prin proteoliză, indicând faptul că ajunge la intestin într-o formă activă și, astfel, poate iniția procese biologice care controlează funcțiile tractului intestinal. Într-adevăr, leptina lumenală crește activitatea transportorului dependent de protoni la marginea periei, PepT1, care îmbunătățește absorbția intestinală a oligopeptidelor (17). Acest lucru crește posibilitatea ca leptina să moduleze și activitatea secretorie a celulelor endocrine intestinale, cu condiția ca leptina să fie prezentă în sucul intestinal.

În acest studiu, am examinat efectele in vitro ale leptinei recombinante asupra eliberării CCK și am investigat mecanismele intracelulare ale acțiunii leptinei în celulele STC-1 care secretă CCK. Am emis ipoteza că leptina care ajunge în duoden este capabilă să moduleze eliberarea CCK. Pentru a testa această ipoteză, am stabilit dacă leptina era prezentă în sucul duodenal și apoi am examinat efectul in vivo al eliberării directe duodenale de leptină asupra concentrațiilor plasmatice de CCK în modelul perfuzat duodenal de șobolan. Am pus sub semnul întrebării relevanța fiziologică a datelor prin analiza modelelor cinetice in vivo ale concentrațiilor plasmatice și insulinei CCK și prin analiza conținutului de leptină din stomac după consumul de alimente la șobolanii Zucker. În cele din urmă, am investigat efectele in vivo ale antagoniștilor receptorilor CCK asupra modificărilor induse de hrănire a acestor parametri.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Cultură de celule.

Celulele STC-1 (un cadou de la Dr. J. Abello, Institutul Național al Sănătății și Cercetării Medicale [INSERM] U-45, Lyon, Franța) sunt derivate din linii de celule tumorale endocrine intestinale dezvoltate de la șoareci care exprimă transgenul pentru promotorul insulinei de șobolan legat de virusul simian 40 antigen T mare și virusul polioma antigen t mic (18). Celulele STC-1 între pasajele 15 și 35 au fost crescute în RPMI-1640 plus glutamină (Sigma, St Louis, MO), suplimentate cu 5% ser fetal bovin, 100 unități/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină, Life Technologies, Grand Island, NY) într-o atmosferă umidificată conținând 95% O2 și 5% CO2 la 37 ° C.

Analiza RT-PCR a receptorilor de leptină.

ARN-ul total a fost extras din celulele STC-1 cu reactivul Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pe scurt, ADNc din prima catenă a fost sintetizat din 2 μg ARN total și a fost transcris invers cu 200 de unități de transcriptază inversă folosind kitul Superscript II (Invitrogen) conform recomandărilor producătorului. Următorii primeri oligonucleotidici au fost sintetizați de Sigma Genosys (Cambridgeshire, Marea Britanie): primerul direct pentru Ob-Rb a fost 5′-ATGAAGTGGCTTAGAATCCCTTCG-3 ′ și primerul invers a fost 5′-ATATCACTGATTCTGCATCCTG-3 ′. Primerii utilizați pentru gena β-actină au fost după cum urmează 5'-CGAGAAGATGACCCAGATCATG-3 'și 5'-AGTGATCTCCTTCTGCATCCTG-3'. Probele au fost denaturate prin încălzire la 95 ° C timp de 3 minute. PCR a fost apoi efectuată în condițiile descrise anterior (14). Produsele PCR au fost separate prin electroforeză într-un gel de agaroză 2%. Gelul a fost colorat cu bromură de etidiu și privit sub iluminare ultravioletă. Mărimile preconizate ale produselor PCR au fost de 375 pb pentru Ob-Rb și 606 pb pentru β-actină.

Analiza Western blot.

Pentru extracția totală a proteinelor, peletele celulare STC-1 au fost omogenizate la 4 ° C în tampon de liză suplimentat cu 0,1 mg/ml fluorură de fenilmetilsulfonil, 100 μmol/l aprotinină și 100 mmol/l NaVO4. Omogenatele au fost centrifugate la 15.000 g timp de 30 de minute la 4 ° C și supernatanții au fost colectați pentru analiza Western blot. Concentrația de proteine ​​a fost cuantificată utilizând testul proteinei Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Pe scurt, proteinele solubilizate au fost rezolvate prin electroforeză pe 7,5% geluri SDS-PAGE. Proteinele rezolvate au fost transferate pe membrane de nitroceluloză și supuse analizei imunoblotului cu un antiser policlonal Ob-Rb crescut la iepure împotriva unei peptide COOH-terminale a receptorului de leptină (aminoacizi 890-903) specific izoformei Ob-Rb (OBR 12 -A; Biotrend Chemicals, Köln, Germania) diluat 1: 750. După o incubare de 1 oră a membranelor cu peroxidază de hrean anti-iepure - anticorp conjugat (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) diluat 1: 1.000, complexele imune au fost detectate prin chemiluminescență îmbunătățită (Pierce, Rockford, IL).

Imunocitochimie.

Celulele STC-1 au fost însămânțate în lamele de sticlă Lab-Tek II cu 4 godeuri (Nalge Nunc International, Naperville, IL). După 2 zile de incubație la 37 ° C cu 95% O2: 5% CO2, mediul a fost îndepărtat și celulele au fost spălate de două ori în PBS rece. Am adăugat apoi un fixativ pentru formalină (4% paraformaldehidă) și am incubat celulele timp de 10 minute. Celulele au fost apoi digerate cu 0,1% pepsină în HCI 0,01N, pH 2,25, timp de 10 minute pentru a extrage antigenul. Înainte de imunoreacție, activitatea endogenă a peroxidazei a fost îndepărtată prin adăugarea de 0,3% H2O2 și incubarea timp de 5 min. Celulele au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu un antiser policlonal Ob-Rb de iepure (OBR 12-A) sau un antiser policlonal Ob-R (TP283) crescut la iepure împotriva unei peptide NH2-terminale a receptorului de leptină (aminoacizi 25-208 ) (Clinisciences, Montrouge, Franța) sau cu un anticorp anti-iepure anti-CCK8 (Sigma), fiecare dintre aceștia fiind diluat 1: 100. Lamele au fost apoi incubate 1 oră la temperatura camerei cu un anticorp anti-iepure de porc urmat de un complex peroxidază-antiperoxidază de iepure Z0113 (Dako, Carpinteria, CA), fiecare diluat 1: 100. Colorarea imunohistochimică a fost efectuată folosind clorhidrat de 3 ', 3'-diaminobenzidină ca cromogen peroxidază (Sigma).