Ceaiul verde polifenoli reduce greutatea corporală la șobolani prin modularea genelor legate de obezitate

Departamentul de Afiliere pentru Toxicologie de Mediu, Institutul de Mediu și Sănătate Umană, Texas Tech University, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, Texas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru patologie, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, Texas, Statele Unite ale Americii

Chuanwen Lu,
Wenbin Zhu,
Chwan-Li Shen,
Weimin Gao

Cifre

Abstract

Citare: Lu C, Zhu W, Shen C-L, Gao W (2012) Polifenolii de ceai verde reduc greutatea corporală la șobolani prin modularea genelor legate de obezitate. PLoS ONE 7 (6): e38332. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038332

Editor: Marcia B. Aguila, Universitatea de Stat din Rio de Janeiro, Centrul Biomedical, Institutul de Biologie, Brazilia

Primit: 10 martie 2012; Admis: 3 mai 2012; Publicat: 8 iunie 2012

Finanțarea: Acest studiu a fost parțial susținut de Institutul Laura W. Bush pentru Sănătatea Femeii și Spitalul Universitar Winthrop. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Peste două treimi dintre adulții din Statele Unite sunt supraponderali sau obezi și peste o treime din S.U.A. adulții sunt obezi [1]. Prevalența obezității crește rapid în multe țări, astfel încât obezitatea este văzută ca o pandemie globală. Consecințele acestui fapt nu sunt numai efectele sociale și psihologice ale greutății excesive, ci și morbiditatea semnificativă și mortalitatea prematură asociate cu afecțiunile medicale grave la care predispune obezitatea, inclusiv diabetul de tip II, hipertensiunea arterială, boala coronariană și diferite forme de cancer [2], [3].

S-a recunoscut că mulți factori de risc, cum ar fi aportul caloric crescut, consumul redus de energie, echilibrul energetic influențat de sistemul nervos central, termogeneza adaptativă, neuropeptidele și neurotransmițătorii, contribuie la obezitate [4]. Rolul interacțiunilor dintre factorii de mediu și genetici în contribuția la obezitatea poligenică complexă și obezitatea comună a fost mai important deoarece nu există în prezent un tratament eficient, în afară de intervenția chirurgicală majoră [5]. Prin urmare, prin descoperirea unor gene noi sau a unor noi căi etiologice, pot fi găsite și/sau utilizate în studiile obezității terapii inovatoare, măsuri preventive și strategii farmacogenetice.

Materiale și metode

Animale și tratamente GTP

Șobolani femele Virgin Sprague Dawley (SD) (n = 36, în vârstă de 3 luni, Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, SUA) au fost găzduiți într-o unitate de îngrijire a animalelor controlată de mediu și aclimatizați timp de 5 zile pe o dietă AIN-93M și apă distilată ad libitum înainte de începerea experimentelor. Dietele s-au bazat pe o modificare a dietei AIN-93M și au fost furnizate de Research Diets Inc. (New Brunswick, NJ, SUA). Aceeași cantitate de minerale și vitamine a fost dată tuturor animalelor.

Izolarea ARN-ului total

Șobolanii (în vârstă de 11 luni) au fost anesteziați și eutanasiați (fără post), iar probele de ficat au fost colectate la sfârșitul experimentului. ARN-ul total a fost izolat din probe de ficat din grupurile martor, HF și HF + GTP folosind un mini kit RNeasy® plus (Qiagen, Valencia, CA) urmând protocolul producătorului, așa cum este descris în studiul nostru anterior [23]. Pe scurt, proba de ficat lizat a fost omogenizată, ADN genomic îndepărtat și purificat. ARN-ul a fost eluat cu 30 pl apă fără RNază și stocat la -80 ° C până la utilizare. ARN-ul total extras a fost determinat prin măsurarea DO la 260 nm folosind un spectrofotometru Nano-Drop 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). Calitatea și puritatea ARN-ului total au fost evaluate prin electroforeză pe gel de agaroză folosind Horizon 11.14 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Eșantioanele totale de ARN utilizate pentru experimentele RT - PCR au avut o integritate bună și au avut rapoarte OD A260/A280 între 1.99-2.08 și concentrație ≥45 µg/mL. Eșantioanele totale de ARN au fost tratate în continuare cu ADN-free ™ DNase (Applied Biosystems, Austin, TX) pentru a elimina posibila contaminare a ADN-ului. Au fost analizate trei replici, fiecare dintre care a fost colectat eșantion de la 3 șobolani individuali din fiecare grup (9 șobolani în total), pentru fiecare grup de control, HF și HF + GTP.

Transcriere inversă-PCR

ADNc a fost preparat folosind un set de cabluri pentru matricea RT 2 PCR (SABiosciences Corporation, Frederick, MD) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 1 µg de ARN total a fost amestecat cu 2 µL de 5 × gDNA tampon de eliminare pentru a forma un volum total de 10 µL amestec de eliminare ADN genomic cu H2O fără RNază, incubat la 42 ° C timp de 5 minute și răcit imediat pe gheață . Amestecul a fost apoi incubat cu un cocktail RTL 10 RTL la 42 ° C timp de 15 minute și reacția a fost oprită prin încălzire la 95 ° C timp de 5 min pentru a inactiva transcriptaza inversă. Amestecul de reacție de sinteză a ADNc de 20 uL a fost diluat la 111 uL adăugând 91 uL H2O fără RNază și păstrat pe gheață pentru utilizare ulterioară.

SYBR® Green RT-PCR pe bază de matrice

(A) Gruparea funcțională a genelor în 3 culori: gene orexigenice în roșu, gene anorectice în galben și gene implicate în consumul de energie în verde. (B) Valoarea CT a controlului calității a utilizat ADN genomic de șobolan.

Analiza IL-1β și IL-6

Probele de ser au fost colectate de la șobolani (11 luni) la sfârșitul experimentului. Citokinele serice proinflamatorii IL-1β și IL-6 au fost analizate de către Bio-Plex ™ Rat Cytokine Panel (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA) cu Luminex 100 Analyzer (Luminex Corporation, Austin, TX) în urma producătorului instrucțiune.

Western Blot

Analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± eroare standard (SE), dacă nu se specifică. Datele privind greutatea corporală au fost analizate printr-o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) cu măsuri repetate urmate de teste post-hoc pentru diferența cea mai semnificativă protejată de Fisher (Fisher’s LSD) pentru evaluarea efectelor timpului și tratamentului. Datele de la RT-PCR au fost cuantificate de software-ul de detectare a secvenței ABI și normalizate de 5 gene de menaj (control endogen). ΔCT a fost definită ca valoarea scăderii valorii CT a controlului endogen din valoarea CT a ARN-ului mesager țintă (ARNm). Modificarea pliurilor între grupuri ar putea fi obținută prin ΔΔCT. Valoarea P mai mică de 0,05 pe baza testului t a fost utilizată ca criteriu pentru determinarea genelor exprimate diferențial. Datele de la biomarkeri serici au fost analizate prin ANOVA unidirecțional, urmate de teste post-hoc Fisher’s LSD pentru a evalua efectele tratamentului. Pentru nivelurile de exprimare a proteinelor printre grupurile de control, HF și HF + GTP, au fost utilizate teste ANOVA unidirecționale și post-hoc ale lui Tukey pentru a compara intensitatea densitometrică a probelor individuale între grupuri. Toate analizele au fost efectuate utilizând software-ul SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA) și diferențele cu P grupul HF + GTP = grupul de control.